环氧化物酶-2与缺氧诱导因子-1a在肺癌组织中的表达及临床意义

林招贤1 陈 新2 吴榕龙1 潘丹玲2

1.福建省立医院胸外科，福建福州 350001；2.福建省立医院病理科，福建福州 350001

[摘要] 目的 探讨环氧化物酶—2(cyclooxygenase2，COX—2)与缺氧诱导因子-1αhypoxia-inducible factor1，HIF—1α)在肺癌组织中的表达及临床意义。方法 随机选取2011年5月—2013年5月在该院治疗的56例肺癌患者的肺癌组织标本，进行病理学检查，其中小细胞癌18例，腺癌9例，鳞癌29例；早期(Ib期，IIIa期)26例，晚期(IIIb期，IV期)30例。应用免疫组化法对56例肺癌组织中的COX-2、HIF-1α的表达进行检测；用原位核酸分子杂交方法检测 H IF～1在非小细胞肺癌癌组织中的表达；同时用CD34单克隆抗体对血管内皮细胞进行标记并计数微血管密度（MVD），对COX-2、HIF-1α与肺癌组织及其血管生成的关系进行统计学分析。 结果 ①56例肺癌组织内COX-2的阳性表达为14例（78.57％），其中在小细胞癌中阳性表达为14例（77.78％），腺癌阳性表达为8例（88.89％），鳞癌阳性表达率22例（75.86％），COX-2阳性表达率不受病理分型影响，差异无统计学意义(P>0.05)；在早期(Ib-IIIa期)肺癌组中COX-2阳性表达率为61.54％，晚期(IHb-IV期)表达率为90.00％，COX-2阳性表达率有病理分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。②56例肺癌组织内HIF-1α阳性表达为45例（89.49％），其中在小细胞癌中阳性表达为17例（94.44％），腺癌阳性表达为7例（77.78％），鳞癌阳性表达为25例（86.21％），HIF-1α阳性表达率不受病理分型影响，差异无统计学意义(P>0.05)；在早期(Ib-IIIa期)的肺癌组中HIF-1α阳性表达率为80.77％，晚期(IIIb-IV期)为93.33％，HIF-1α有病理分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。③COX-2弱阳性的MVD值为13.32±8.91，较强阳性为19.20±9.98，强阳性为23.04±5.69，在病灶部位MVD随着COX-2表达强度增加而增加，差异有统计学意义(P<0.05)；HIF-1α弱阳性MVD值为13.78±4.59，较强阳性为21.59±8.25，强阳性为28.58±2.59，在病灶部位MVD随着HIF-1α表达强度增加而增加，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 COX-2、HIF-1α对于肺癌组织及其血管的生成具有重要作用，探讨分析COX-2、HIF-1α在肺癌组织中的作用对于治疗肺癌具有重要意义。

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关键词 ] 环氧化物酶-2；缺氧诱导因子-1α；肺癌组织；临床意义

[中图分类号] R725 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）09（a）－０009-03

[作者简介] 林招贤（1978.10-），男，福建惠安人，硕士，主治医师，主要从事胸外科肿瘤与免疫的研究工作。

实体肿瘤的特征之一使缺氧，若缺氧状态下恶性肿瘤仍能不断浸润、生长，说明癌组织对缺氧适应能力很强，而这种能力主要由生成血管及增加糖酵解实现[1,2]。目前对癌组织长、浸润的研究发现，癌组织在缺氧状态下的生长主要与COX-2、HIF-1α有关[3,4]。该研究中，随机选取2011年5月—2013年5月在该院治疗的56例肺癌患者的肺癌组织标本进行病理检查，应用免疫组化法，对肺癌组织中的COX-2、HIF-1α的表达进行检测，用CD34对肿瘤组织的微血管密度(microvessel density，MVD)进行检测，探讨COX-2、HIF-1α的表达及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集在该院治疗的肺癌病人的组织标本56例，经病理实验证实均属肺癌组织。其中男39例，女17例；年龄47~81岁，平均(64.69±6.45)岁；小细胞癌18例，腺癌9例，鳞癌29例。根据美国联合癌症分类委员(AJCC)与国际抗癌联盟(UICC)2002制订的TNM分期标准：Ib期3例，IIb期6例，IIIa期14例，IIIb期11例，IV期21例。早期(Ib期，IIIa期)26例，晚期(IIIb期，IV期)30例。

1.2 试剂

HIF-1α兔抗人多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），浓度1：50。COX-2、CD34、超敏S-P试剂盒为即用型（福州迈新生物技术工程公司）。

1.3 方法

步骤运用免疫组化法，步骤如下。①用10%福尔马林固定标本，石蜡包埋，将切片（4 μm）用二甲苯脱蜡，用梯度乙醇进行水化；②用3％过氧化氢溶液在室温下浸泡20 min，并用磷酸盐溶液（PBS）冲洗2次；③将切片放入枸橼酸溶液100 ℃水浴加热15 min，待自然冷却后用磷酸盐溶液冲洗2次；④将山羊血清密封，37 ℃恒温孵育20 min；⑤将血清弃去，分别滴加HIF-1α兔抗人多克隆抗体稀释液以及COX-2、CD34，4 ℃恒温孵育一夜，并用PBS冲洗2次；⑥滴加通用型IgG生物素化，在室温下孵育30 min，并用PBS冲洗2次；⑦滴加比例适当的辣根酶标记链酶卵白素(经PBS稀释)，在室温下孵育30 min，用PBS冲洗2次；⑧显色，用苏木素进行复染、脱水、透明、封片，并用显微镜进行观察。

1.4 判定标准

HIF-1α参照Bimer等[5]研究方法，细胞浆或细胞核内出现棕黄色颗粒即为阳性，在400倍高倍镜下每张切片随机选取5个视野观察，每个视野计数细胞200个，共计数1 000个。根据染色强度及阳性细胞率半定量处理：染色强度评分标准：1分：弱染色但较阴性对照强；2分：染色较强；3分：染色强；细胞阳性率评分标准：2分：阳性率11％~50％；3分：阳性率51％~80％；4分：阳性率>81％。两项评分结果相加，阳性率<10％者，均为阴性表达(-)；其余3分弱阳性(+)；4~5分中度阳性(++)；6~7分强阳性(+++)。COX-2判定标准如上。MVD参照Weidner[6]的报道方法，于40倍物镜下寻找高密度血管区，在200倍高倍镜下观察3个视野内被CD34染为棕色的血管数目，计算平均值。

1.5 统计方法

应用spssl7.0软件对研究数据进行分析，计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料采取χ2检验。

2 结果

2.1 COX-2、HIF-1α在肺癌组织中的表达情况

COX-2主要在胞浆中表达，为棕黄色。56例肺癌组织中阳性表达为44例（78.57%）；其中，弱阳性为18例（40.91%）；中度表达为16例 (36.36%)；强表达10例 (22.73%)。HIF-1α主要在胞核或胞浆中表达，为棕黄色。56例肺癌组织中阳性表达为45（80.36%），其中，弱阳性为17例（37.78%），中度表达为13例（28.89%），强表达为15例（33.33%）。

2.2 COX-2、HIF-1α阳性率与病理分型的关系

56例肺癌组织中COX-2阳性为44（78.57％），其中小细胞癌阳性表达率77.78％，腺癌阳性表达率88.89％，鳞癌阳性表达率75.86％。HIF-1α阳性率为45（80.36％），其中小细胞癌阳性表达率94.44％，腺癌阳性表达率77.78％，鳞癌阳性表达率为86.21％。COX-2、HIF-1α阳性率均不受病理分型影响，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 COX-2、HIF-1α阳性率与病理分期的关系

COX-2在早期肺癌组中阳性表达率为61.54％（16/26），晚期表达率为90.00％(27/30), COX-2与病理分型有关，差异有统计学意义（χ2=12.839，P<0.05）；HIF-1α在早期肺癌组中阳性表达率为80.77％（21/26），晚期为93.33％（28/30），HIF-1α与病理分型有关，差异有统计学意义（χ2==9.286，P<0.05）。见表2。

2.4 COX-2阳性率与MVD的关系

COX-2弱阳性的MVD值为（13.32±8.91），较强阳性为（19.20±9.98），（强阳性为23.04±5.69），MVD随着COX-2表达强度增加而增加，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.5 HIF-1α阳性率与MVD的关系

HIF-1α弱阳性MVD值为（13.78±4.59），较强阳性为（21.59±8.25），强阳性为（28.58±2.59），MVD随着HIF-1α表达强度增加而增加，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

由于癌组织在缺氧环境下亦能生长、浸润，因此随着对癌组织研究的不断深入，发现COX-2与HIF-1α在癌组织中异常表达，Marxsen[7]对肺癌、皮肤癌、前列腺癌、乳腺癌等进行分析，发现癌组织中HIF-1α呈过表达，特别是肿瘤坏死区域及肿瘤浸润边缘更加明显，而肿瘤组织的基质细胞及邻近正常组织中未见HIF-1α表达。Shoslow等[8]采用免疫组化法对60例肿瘤组织的石蜡切片进行检测，包括肺癌(腺癌、鳞癌)、乳腺癌、结肠癌，发现COX-2在90％的肺癌、56％的乳腺癌、71％的结肠癌中显示中度甚至高度表达。Tomozawa等[9]认为COX-2产生的血栓素、前列腺素是形成新血管的必要因素，它们能够诱导VEGF生成，增使血管通透性增加，并增血流量，同时还可以抑制内皮细胞的凋亡，从而促进血管的生成。

在该研究中证实COX-2和HIF-1α与癌组织病理分期具有重要关系，COX-2在早期肺癌组中阳性表达率为61.54％，晚期表达率为90.00％；HIF-1α在早期肺癌组中阳性表达率为80.77％，晚期为93.33％。而且MVD的强度COX-2和HIF-1α的阳性状态的增强而增强。但研究发现COX-2和HIF-1α与癌组织的病理分型关系不大。由此可见COX-2和HIF-1α对于癌组织在缺氧状态下血管的生成具有重要作用。而且对于新的有关影响癌组织血管生成的因素的研究也在继续，在未来的抗肿瘤研究领域将有更多有利于癌症治疗的方法出现。这就使得恶性肿瘤的治疗希望越来越大。

综上所述，对COX-2与HIF-1α的研究及其调控对于抑制肿瘤血管的生长方面拥有广阔的前景及价值，在今后的抗肿瘤治疗中势必会成为新靶点。而COX-2与HIF-1α的相互影响及关系，也将成为治疗肿瘤的有力依据。同时也替该院应该继续加大对其他有关其组织形成的基因的研究，以便于全面的综合的对恶性肿瘤进行治疗。

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参考文献]

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[3] Diano S, Horvath TL.Mitochondrial uncoupling protein2(UCP2)in glucose and lipid metabolism[J]. Trends in Molecular Medicine ,2012,6(9):18-20.

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[5] Bimer E，Schindl M，Obermair A，et a1．Over expression of hypoxia-inducible factor lalpha is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer[J]．Cancer Res，2000，60(17)：4693-4699．

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[9] Tomozawa S，Tsuno NI-I，Sunaml E，et al．Cyclooxygenase-2over Expression correlates with tumor recurrence especially hematogenous metastasis of colorectal cancer[J]．Br J Cancer，2000（61）：324-328．

（收稿日期：2014-06-03）