樱桃谷肉鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗母源抗体消长规律及免疫程序研究

刘 琨

（信阳市动物疫病预防控制中心，河南 信阳 ４６４０００）

摘要：选取１日龄健康无免疫的樱桃谷肉鸭４８０羽，随机分成Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ ４组，每组１２０羽。Ｂ、Ｃ和Ｄ组在１０日龄分别免疫Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗０．５、０．８和１．０ ｍＬ/羽，Ａ组为非免疫对照组。用ＨＩ方法检测其母源抗体和免疫抗体，根据母源抗体和免疫抗体消长规律，探讨樱桃谷鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗的合理免疫程序。结果表明，樱桃谷鸭母源抗体效价和抗体合格率在１日龄最高，分别为６．６ ｌｏｇ２和９６．７％，１４日龄下降至３．８７ ｌｏｇ２和５６．７％，２１日龄之后几乎没有保护力；３个试验组免疫抗体水平和抗体合格率在统计学上差异不显著（Ｐ＞０．０５），建议免疫程序为：１０日龄免疫，免疫剂量０．８ ｍＬ/羽。

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关键词 ：Ｈ５Ｎ１高致病性禽流感；母源抗体；免疫程序；血凝抑制试验；ＨＩ抗体效价；抗体合格率

中图分类号：Ｓ８５９．７９＋７ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0402-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.036

河南信阳地区河网密布，非常适合鸭鹅等水禽的养殖。近年来，信阳地区养鸭业呈持续迅猛发展的态势，其饲养量和存栏量连年增长。肉鸭因其饲养周期短、成本低、出栏早，养殖规模在信阳市各县（区）逐步扩大。目前，全市肉鸭存栏量已达１ ８００万只，年出栏５ ０００万只，均居河南省首位。

随着肉鸭养殖业的发展，鸭病尤其是鸭病毒性疾病（鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭副黏病毒病等）的流行日趋严重，特别是禽流行性感冒对肉鸭养殖业的打击甚至是毁灭性的。禽流行性感冒简称禽流感（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ），是由禽流感病毒引起的传染病。ＡＩＶ根据其对家禽致病力的不同分为３种，即高致病性、低致病性和无致病性。Ｈ５Ｎ１高致病性禽流感病毒（ＨＰＡＩＶ）是严重危害禽类的病原之一，并且对人类健康威胁较大［１］，该亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒，已在世界上多个国家发生流行，给禽类养殖业带来了巨大的经济损失［２］。近年来，Ｈ５Ｎ１亚型禽流感流行出现新特点：感染对象种类不断增多，宿主范围不断扩大，水禽不仅能感染，还能引起大量死亡。因此，预防和控制水禽的Ｈ５Ｎ１禽流感感染具有重要的公共卫生学意义。现阶段，预防肉鸭禽流感病毒感染主要依靠给肉鸭接种Ｈ５Ｎ１亚型禽流感灭活疫苗。根据农业部及河南省畜牧局的要求，信阳地区从２０１２年５月份开始，水禽使用Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６）灭活株疫苗进行防疫，养殖户在其饲养周期内何时免疫高致病性禽流感疫苗、剂量多少，国内尚未见相关的试验数据及合理的免疫程序报道。为探讨重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５ＮＩ亚型，Ｒｅ－６株）对肉鸭的免疫效果，根据国家强制免疫计划及相关研究［３，４］，本试验选用相同日龄樱桃谷肉鸭采用不同剂量疫苗对其进行免疫接种并监测其抗体消长规律，以制定出合理的免疫程序，为预防和控制肉鸭禽流感提供参考。

１ 材料与方法

１．１ 试验时间

试验时间为２０１３年９～１２月。

１．２ 试验用疫苗

重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１亚型，Ｒｅ－６株）由辽宁益康生物股份有限公司提供，批号：２０１３０８０１。

１．３ 检测试剂及仪器设备

１．３．１ 检测试剂 禽流感Ｈ５亚型（Ｒｅ－６株）血凝抑制试验诊断抗原（批号：２０１３００５）和禽流感Ｈ５亚型（Ｒｅ－６株）阴、阳性血清（批号：２０１３００４）。

１．３．２ １％鸡红细胞悬液 采集２～３羽无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液自行配制。

１．３．３ 仪器设备 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ １０～１ ０００ μＬ单道移液器及２５～３００ μＬ多道移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；３０３系列电热恒温培养箱（上海树立仪器仪表有限公司）；ＴＤＺ５－ＷＳ型台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

１．４ 试验动物及分组

１日龄健康无免疫的樱桃谷肉鸭４８０羽，潢川县华英集团某饲养场专人饲养。将雏鸭随机分成Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ ４组，每组１２０羽，Ａ组为非免疫对照组，其余各组均为试验组。Ｂ、Ｃ和Ｄ组在１０日龄分别免疫重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５Ｎ１亚型，Ｒｅ－６株）０．５、０．８、１．０ ｍＬ/羽。

１．５ 试验方法

１．５．１ 采样 各组分别在１、７、１４、２１、２８、３５、４２日龄时随机抽取３０羽翅静脉采血，每羽１～２ ｍＬ，分离血清后冷冻保存备检。

１．５．２ 检测 禽流感抗体检测采用血凝试验（ＨＡ）及血凝抑制试验（ＨＩ），具体方法按照《高致病性禽流感诊断技术》（ＧＢ／Ｔ１８９３６－２００３）进行。

判定标准：以完全抑制４单位抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的ＨＩ效价。当阳性对照血清的ＨＩ效价与被检血清ＨＩ效价误差不超过１个滴度，阴性对照血清的ＨＩ效价不高于２ｌｏｇ２时，试验方可成立。被检血清ＨＩ效价≤３ｌｏｇ２判为阴性；ＨＩ效价≥４ｌｏｇ２判为阳性；３ｌｏｇ２＜ＨＩ效价＜４ｌｏｇ２判为可疑（可疑样品应重检，重检效价≥４ｌｏｇ２判为阳性，≤３ｌｏｇ２判为阴性）。

１．６ 数据处理

ＨＩ效价采用算术平均数表示，群体免疫合格情况即抗体合格率，抗体合格率＝合格抗体数／检测数×１００％，群体免疫抗体阳性率达到７０％判定为群体合格。不同试验组检测结果采用Oｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析差异显著性，Ｐ＜０．０５时差异显著，Ｐ＜０．０１时差异极显著。

２ 结果与分析

２．１ 不同日龄樱桃谷肉鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗母源抗体检测情况

由图１可见，雏鸭母源抗体效价在１日龄最高，平均值达到６．６ ｌｏｇ２，有较好的保护力；随着日龄增长，母源抗体开始下降，至１４日龄，ＨＩ效价平均值为３．８７ ｌｏｇ２，保护作用大大降低；至２８日龄，鸭群基本无母源抗体，已起不到保护作用。

２．２ 不同日龄樱桃谷肉鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗保护性母源抗体群体合格率情况

由图２可见，雏鸭在１日龄时，母源抗体群体合格率为９６．７％；至７日龄时，还有９０％的个体达到保护要求；至１４日龄时，检测的３０只雏鸭中有１３只抗体效价在４ｌｏｇ２以下，抗体合格率已经下降至５６．７％；至２１日龄时仅有２只鸭抗体效价在４ｌｏｇ２以上，其合格率仅为６．７％；２８日龄以后，整个鸭群无有效禽流感保护性抗体。

２．３ 试验组不同日龄樱桃谷鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗免疫抗体消长情况

由图３和图４可见，Ｂ、Ｃ和Ｄ组ＨＩ效价均值及抗体合格率均是在１４日龄达到最低值，此后逐渐上升。对Ｂ、Ｃ和Ｄ组的ＨＩ效价均值进行生物统计分析，差异不显著（Ｐ＞０．０５）；对Ｂ、Ｃ和Ｄ组的抗体合格率进行生物统计分析，差异也不显著（Ｐ＞０．０５）。总体而言，以Ｃ组稍好。

３ 小结与讨论

３．１ 樱桃谷肉鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗母源抗体消长规律

有研究表明，种鸭产生的免疫抗体可以通过卵黄传递给雏鸭，起到天然被动免疫的作用，保护雏鸭抵抗禽流感病毒的侵袭［５］。ＨＩ效价≥４ｌｏｇ２时，可以保护鸭体免受禽流感野毒感染。本试验通过对不同日龄的樱桃谷肉鸭母源抗体消长变化的观察发现，在７日龄之前，鸭群中９０％以上的个体ＨＩ效价在４ｌｏｇ２及以上，获得的母源抗体可以有效保护鸭群；至１４日龄时，ＨＩ效价均值仅为３．８７ｌｏｇ２，鸭群仅有５６．７％的个体有保护性抗体；雏鸭在２１日龄还能够检测到极低的母源抗体，鸭群中６．７％的个体还有一定的保护力；２８日龄之后，鸭群所有个体的ＨＩ效价均在４ｌｏｇ２以下，鸭群已经丧失对禽流感病毒的抵抗力。

３．２ 樱桃谷肉鸭Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗免疫程序

重组禽流感病毒灭活疫苗（Ｈ５ＮＩ亚型，Ｒｅ－６株）是农业部兽医局根据病毒流行病学监测情况和疫苗评估结果以及专家评审意见授权疫苗厂家生产的用于防控水禽禽流感的产品［６］，目前国内还未见该疫苗免疫水禽的试验研究报告。一般认为，家禽日龄和品种不同，对疫苗免疫的敏感性也不一致，ＨＩ抗体产生的时间和所能达到的高度及维持的时间也存在差别［７］。鸭的高致病性禽流感免疫一般需要二次免疫才能得到较高的免疫抗体［８］。由于樱桃谷肉鸭饲养周期短，４５ ｄ就出栏，免疫时机和剂量的选择就显得尤为重要。本研究中，根据国家免疫计划要求免疫的时间段和相关研究，选在１０日龄，对樱桃谷肉鸭进行了３个剂量Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗免疫程序的研究。３个试验组的ＨＩ效价均值在试验期间均在４ ｌｏｇ２以上，０．８和１．０ ｍＬ组的抗体合格率均在７０％以上。综合来看，在１０日龄对樱桃谷肉鸭注射０．８ ｍＬ/羽Ｈ５Ｎ１亚型禽流感（Ｒｅ－６株）灭活疫苗是比较合理的免疫程序。

３．３ 讨论

禽流感对鸭群危害极大，一旦发病，会给养殖场（户）带来巨大的损失，所以对该病的防疫就显得尤为重要，为提高禽流感疫苗对樱桃谷肉鸭的免疫效果，建议采取如下措施：①疫苗的免疫接种要严格按照说明书进行，免疫注射时要轻逮轻放。②提高禽群的免疫力和抗应激能力。在免疫前后，给禽群的饮水或饲料中添加黄芪多糖、植物血凝素和蜂灵散等免疫促进剂促进鸭群的免疫应答［９］，添加适量的电解多维等营养性药物以提高其抗应激能力。③要加强对防疫人员的培训，确保免疫效果和免疫密度。

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参考文献：

［１］ 郭元吉．高致病性禽流感研究进展［Ｊ］．中华实验和临床病毒学杂志，２００６，２０（２）：９０－９３．

［２］ 冯书营，董仕桢，张树逍．Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒疫苗的研究现状及应用前景［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１３，４０（９）：２０８－２１３．

［３］ 陈培赛，林昌荣，薛成俊，等．樱桃谷肉鸭超早期接种禽流感（Ｈ５Ｎ１）疫苗的免疫效果试验［Ｊ］．浙江畜牧兽医，２０１０（６）：２９．

［４］ 胡思顺，郭 锐，刘 梅，等．禽流感灭活疫苗对商品肉鸭免疫效果的评价［Ｊ］．湖北农业科学，２００７，４６（６）：９６３－９６５．

［５］ 何芳兴．樱桃谷肉鸭禽流感母源抗体消长规律研究及最佳首免日龄的探讨［Ｊ］．福建畜牧兽医，２００８，３０（１）：９．

［６］ 曾显营，田国彬，冯华朋，等．Ｈ５Ｎ１亚型禽流感灭活疫苗种毒Ｒｅ－６株的生物学特性及免疫原性研究［Ａ］．第三届（２０１２）中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊［Ｃ］．江苏扬州：《中国家禽》编辑部，２０１２．２３３－２３７．

［７］ 金大春，王跃川，潘杭君，等．快速型肉鸡禽流感母源抗体消长变化的观察及最佳首免日龄的探讨［Ｊ］．中国家禽，２００８，３０（２４）：５４－５５．

［８］ 卫龙兴，俞财荣，王福泉，等．白羽肉鸭高致病性禽流感疫苗免疫效果研究［Ｊ］．现代农业科技，２００９（２１）：２６３－２６４．

［９］ 张济培，陈建红，刘佑明，等．白鸭禽流感Ｈ５亚型疫苗免疫促进剂的筛选［Ｊ］．中国兽医杂志，２０１２，４８（７）：２７－２９．

（责任编辑 曾德芳）