云南红豆杉茎灰斑病病原菌分离鉴定和生物学特性研究

谢美华１，李霖２，李雪玲１，杨海艳１，陈华红１，王振吉１，范树国１

（１．楚雄师范学院化学与生命科学系，云南 楚雄６７５０００；２．楚雄医药高等专科学校信息中心/云南省高校应用生物学重点实验室，云南 楚雄６７５０００）

摘要：对红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌｕ）茎灰斑病进行病原鉴定，并研究其生物学特性和杀菌剂对其抑制作用。结果表明，该病原菌为拟茎点霉属真菌；该病原菌最适宜生长的碳源为甘油，氮源为硝酸铵。菌丝适宜生长的温度范围较窄，２５～２８ ℃ 菌丝生长良好，分生孢子在３２ ℃时萌发率最高；菌丝适宜生长的ｐＨ范围均较广，分生孢子萌发率较高，菌丝适宜生长的ｐＨ为６．０～７．０，弱酸性更利于孢子萌发；光周期对菌落生长和分子孢子萌发的影响都不大。供试的杀菌剂中以代森锰锌的抑菌效果最好。

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关键词 ：云南红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌｕ）；茎灰斑病；病原鉴定；生物学特性

中图分类号：Ｓ７１８．８１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0608-04

云南红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌｕ）又名紫杉、赤柏松，属红豆杉科乔木，产于云南西北部及西部、四川西南部与西藏东部［１］。主要生长在山坡、针阔混交林中。云南红豆杉的茎皮中富含具有抗癌活性成分的紫杉醇，由此使得红豆杉身价急剧上升。自然环境中的红豆杉资源非常稀缺，所以目前红豆杉已被大面积的人工栽培。围绕云南红豆杉的研究主要集中在浸种育苗、扦插栽培、内生真菌研究等方面，而对于云南红豆杉大面积栽培引起病害大量滋生及病害如何防治的方面［２－7］鲜见报道。本研究选取红豆杉茎皮灰斑病的病斑，进行该病害病原的分离鉴定和生物学特性研究，以期为云南红豆杉病害控制和防治提供一定的理论基础。

１材料与方法

１．１病原菌分离

云南红豆杉茎灰斑病茎皮采自楚雄师范学院内，用组织分离法进行病原菌株分离，经柯赫氏法则鉴定其为云南红豆杉茎灰斑病的病原，菌株编号为ｈｏｎｇｄｏｕｓｈａｎ０１。

１．２病原菌鉴定

１．２．１形态学鉴定经纯化分离得到病原菌，利用显微镜进行观察，对其进行形态鉴定。

１．２．２病原茵ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列扩增和分析用ＣＴＡＢ法提取病原菌全基因组ＤＮＡ，进行ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增。引物序列为ＩＴＳ４：５－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴ

ＡＴＧＣ－３；ＩＴＳ５：５－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧ

Ｇ－３。ＰＣＲ反应体系总体积２５ μＬ，反应各成分终浓度为：Ｔａｑ酶０．０２ Ｕ/μＬ；引物０．４ μｍｏｌ／Ｌ；ＤＮＡ 模板２０ ｎｇ/μＬ；ｄＮＴＰｓ ０．４ μｍｏｌ／Ｌ；２×ＰＣＲ反应缓冲液。ＰＣＲ扩增程序为：预变性９５ ℃，３ ｍｉｎ；变性９４ ℃，３０ ｓ，退火５２ ℃，４５ ｓ， 复性７２ ℃，４５ ｓ，３０个循环；延伸７２ ℃，１０ ｍｉｎ。扩增产物送北京百泰克生物技术有限公司测序，所得序列在ＮＣＢＩ上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，用ＢｉｏＥｄｉｔ、Ｃｌｕｓｔａｌ ｘ和ＭＥＧＡ ４．１软件采用ＮＪ法进行系统分析，构建系统进化树。

１．３生物学特性研究［8,9］

１．３．１不同碳源和氮源对菌落生长的影响以察氏培养基为基础培养基，分别以葡萄糖、甘油、Ｄ－果糖、Ｄ－半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分别以硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、Ｌ－苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每种培养基中分别接种直径为５ ｍｍ的菌块，２５ ℃恒温暗室培养，５ ｄ后用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设３个重复。

１．３．２不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响取直径为５ ｍｍ的菌块接种于察氏培养基中央，分别在５、１０、１５、２０、２５、２８、３０、３２、３５、４０、４５ ℃暗室下恒温培养，５ ｄ后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，２４ ｈ后镜检孢子萌发率，每次检１００个孢子。每个处理设３个重复。

１．３．３不同ｐＨ对菌落和孢子萌发的影响将高压灭菌后的察氏培养基ｐＨ分别调为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１０．９，倒平板，取直径５ ｍｍ的菌块接种于察氏培养基中央，黑暗条件下２５ ℃培养５ ｄ后测量菌落直径。用０．２ ｍｏｌ/Ｌ磷酸氢二钠和０．２ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓冲液将分生孢子悬浮液ｐＨ调配为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１０．９，置于２５ ℃恒温箱暗室培养，２４ ｈ后镜检萌发率，每次检１００个孢子。每个处理设３个重复。

１．３．４不同光照处理取直径为５ ｍｍ的菌块接种于察氏培养基中央，分别置于２４ ｈ光照、１２ h/１２ h光暗交替，２５ ℃培养５ ｄ后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，２４ ｈ后镜检孢子萌发率，每次镜检１００个孢子。每个处理设３个重复。

１．４不同杀菌剂对菌落生长的影响

将代森锰锌、百菌清、敌克松、恶霜锰锌和扑海因用无菌水按其常用倍数稀释，每１０ ｍＬ培养基中加入１ ｍＬ药液制成含药液的平板，对照组加入等量无菌水。取５ ｍｍ菌块置于察氏培养基平板中央，２５ ℃暗室培养５ ｄ后测量菌落直径。每个处理设３个重复。

２结果与分析

２．１云南红豆杉病原菌的鉴定

２．１．１形态学鉴定该病主要发生在茎部，发病初期茎皮部出现黑色病斑或病块，病情严重时，病块可延伸至整株植物的茎。在ＰＤＡ培养基上，２８ ℃培养第3天菌落直径２ ｃｍ ，不规则，不透明；菌丝深褐色、絮状、短，外周为白色絮状极短菌丝，背面深褐色，外周为白色；菌丝生长较慢，２８ ℃培养第７天菌落直径为５ ｃｍ；培养第15天长满全皿，培养基正面不均匀分布黑色小圆点，背面出现少量小黑点；培养第20天，正面有黏稠的分泌物出现（图１）。分生孢子座为真子座，埋生或半埋生，后暴露，黑色，球形或不规则形，分散或合生，含单腔、多腔，腔壁厚，周边颜色深，无孔口，孢子团冲破上壁而开裂；分生孢子梗缺；产孢细胞无色至淡褐色，安瓿瓶状，内壁芽生瓶体式产孢，产孢口宽，围领及平周加厚不明显；分生孢子无色，单胞，椭圆形，光滑，大小２．５～５．３ μｍ×３．２～４．９ μｍ（平均３．６ μｍ×４．２ μｍ）（图２与图３）。

２．１．２病原菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析将云南红豆杉０１菌株的５．８Ｓ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列在ＮＣＢＩ里进行序列比对，结果显示hongdoushan０１与Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｅｒｅｓ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ａｍｙｇｄａｌｉ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｉｉ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｍａｇｎｏｌｉａｅ和Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｊｕｇｌａｎｄｉｎａ同源性最高，下载它们的序列，以Ｐｈｏｍａ ｓｐ．和Ｐｈｏｍａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ为外群，用ＢｉｏＥｄｉｔ、Ｃｌｕｓｔａｌ ｘ和ＭＥＧＡ ４．１软件采用ＮＪ法进行系统分析，构建系统进化树。结果显示与其遗传距离较近的有６个种，属内节点支持率为０．９９，结合其形态特征的观察研究，供试菌株hongdoushan０１为拟茎点霉属（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ．）。

２．２不同氮源和碳源对ｈｏｎｇｄｏｕｓｈａｎ０１菌落生长的影响

试验结果表明，该菌对供试的７种氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异。最适该菌生长的氮源是硝酸铵，其在１％差异水平与甘氨酸、硝酸钠作氮源达到极显著差异，与硫酸铵、牛肉膏和蛋白胨作氮源在５％差异水平达到显著差异。最适该菌生长的的碳源是甘油，在５％差异水平与葡萄糖、Ｄ－果糖、可溶性淀粉和蔗糖达到显著差异，在１％差异水平与Ｄ－半乳糖与乳糖达到极显著差异（见表１）。

２．３不同光照对ｈｏｎｇｄｏｕｓｈａｎ０１菌株生长的影响

通过２４ ｈ光照，１２ ｈ/１２ ｈ光／暗交替、无光照培养，结果表明（表２），有无光照对菌落的生长和分生孢子萌发的影响差异不显著。

２．４不同温度对ｈｏｎｇｄｏｕｓｈａｎ０１菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，该病原菌在１５～３０ ℃范围内均能生长，最适的生长温度是２８ ℃，与２０、２５和３０ ℃在５％水平存在显著差异，与其他处理在１％显著水平达到极显著差异；该病原菌在５、１０、３２、３５、４０、４５ ℃条件下停止生长。该病原菌孢子在５～４０ ℃范围内均能萌发，最适萌发温度为３２ ℃，高于４０ ℃孢子无法萌发，与２０、２５、２８、３５ ℃在５％水平存在显著差异，与其他处理在１％水平显著水平达到极显著差异（表３）。

２．５不同ｐＨ对ｈｏｎｇｄｏｕｓｈａｎ０１菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，菌丝和分生孢子萌发适应的ｐＨ值范围较广，在ｐＨ ２．５～１０．９之间均能生长和萌发。该菌菌丝在酸性条件下生长较好，在碱性条件下生长缓慢；该菌生长最适宜的ｐＨ为７．０，与ｐＨ为３．０～６．０处理差异不明显，与ｐＨ为８．０～１０．９处理在５％水平存在显著差异。当ｐＨ ６．０时孢子萌发率最高，ｐＨ ６．０时的孢子萌发率与ｐＨ ４．０、５．０、７．０和９．０时孢子萌发率在５％水平存在显著差异，与其它处理达到极显著差异（表４）。

２．６不同杀菌剂对菌落生长的影响

试验结果表明，与对照相比，５种广谱杀菌剂对该菌的生长均有抑制作用（图5）。代森锰锌对该菌的抑制效果最好，随后依次是百菌清、扑海因、恶霜锰锌，效果最差的是敌克松。代森锰锌的抑菌效果在５％差异水平与扑海因、百菌清达到差异显著，与敌克松和恶霜锰锌在１％水平达到极显著差异。

３小结与讨论

３．１病原菌的分离鉴定

自然分布的云南红豆杉原先主要生长在深山中，由于具有抗癌活性的紫杉醇的发现，使云南红豆杉的药用价值得以认识，目前已有很多地方进行大面积栽培。大面积栽培使病害发生严重，而目前还未见对云南红豆杉茎灰斑病病原菌的报道。本研究通过对云南红豆杉茎灰斑病病原菌进行分离纯化，利用形态学特征观察并结合分子生物学手段进行分析鉴定［１0，１1］，结果表明，两者的鉴定结果相互吻合一致，初步推测病原菌为拟茎点霉属真菌。

３．２病原菌生物学特性研究

本研究结果表明，该菌对供试的７种氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异，最适该菌生长的的氮源是硝酸铵，最适该菌生长的碳源是甘油。该病原菌在１５～３０ ℃范围内均能生长，最适的生长温度是２８ ℃，在５、１０和３２℃及以上温度条件下停止生长；该病原菌孢子在５～４０ ℃范围内均能萌发，高于４０ ℃孢子无法萌发； 有无光照对菌落生长和孢子萌发无显著影响；菌丝和分生孢子萌发适应的ｐＨ范围较广，偏酸的条件下对菌丝生长和孢子萌发较好，孢子萌发最适宜的ｐＨ为６．０。

３．３广谱杀菌剂对该菌生长的影响

在本研究中５种广谱杀菌剂对该菌落的生长均有抑制作用。代森锰锌对该菌的抑制效果最好，随后依次是百菌清、扑海因、恶霜锰锌，效果最差的是敌克松。该菌的生物学特性研究都是在实验室中进行，相对于大田种植时复杂的生长环境，实验室的环境相对单一。因此，要确定该病害的生物学特性，哪一种杀菌剂对该菌的抑制作用最好，还有待进一步的大田试验研究。

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