SPE和HPLC对微生物降解体系中十溴联苯醚含量的测定

赵银平，赵晓祥，王 玥

（东华大学环境科学与工程学院，上海 ２０１６２０）

摘要：采用固相萃取法提取菌ＧＨ１０降解体系中的十溴联苯醚（ＢＤＥ－２０９），高效液相色谱法测定十溴联苯醚的含量，并对各种试验条件进行了优化。结果表明，固相萃取的最佳洗脱剂为正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ），最佳洗脱体积为４ ｍＬ（２ ｍＬ×２）；高效液相色谱法的最佳检测条件：检测波长为２６０ ｎｍ，柱温箱温度为３０ ℃，流动相为乙腈∶水（９５∶５，Ｖ／Ｖ），流动相流速为１．２ ｍＬ／ｍｉｎ，在此条件下 ＢＤＥ－２０９的出峰时间为２４．７０５ ｍｉｎ；菌ＧＨ１０在３ ｄ内能够快速降解高浓度ＢＤＥ－２０９（５０ ｍｇ／Ｌ），第３天的降解率达到最高为５９．２４％。通过固相萃取法和高效液相色谱法能够快速提取和检测微生物降解体系中的十溴联苯醚，该方法操作简单，节省时间。

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关键词 ：十溴联苯醚（ＢＤＥ－２０９）；固相萃取法（SPE）；高效液相色谱法（HPLC）；菌ＧＨ１０；降解率

中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1198-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.043

收稿日期：２０１４－０４－１０

基金项目：上海市基础研究重点项目（０９ＪＣ１４００６００）

作者简介：赵银平（１９８９－），女，河南林州人，在读硕士研究生，研究方向为环境微生物学，（电话）１８８１８２３６９２４（电子信箱）ｒｅｎｇｅｂｅｎｇｃｕｉ＠１６３．ｃｏｍ；

通信作者，赵晓祥，研究员，硕士生导师，主要从事有机污染物的降解、监测与分析等相关研究,（电子信箱）ｚｘｘ＠ｄｈｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。

多溴联苯醚（ＰＢＤＥｓ）是一类高效添加型溴系阻燃剂，被广泛应用于各种电子、电器、纺织、建材等产品中［１，２］。而这些产品在大量生产、使用和废弃的过程中，均不同程度地使ＰＢＤＥｓ进入各种环境介质当中，甚至在人的毛发和母乳中都能检测到［３－６］。据研究表明，ＰＢＤＥｓ具有致癌性及内分泌干扰毒性［７－１２］，因此环境中的ＰＢＤＥｓ严重威胁人类健康及生态安全。

多溴联苯醚中的十溴联苯醚（ＢＤＥ－２０９）因其具有溴化程度高，阻燃性能好，价格低等优点，所以是使用最多的一种ＰＢＤＥｓ［１３，１４］。目前，环境样品和生物样品中ＢＤＥ－２０９的提取方法主要有索氏提取、液液萃取、超声波辅助萃取和固相萃取（ＳＰＥ）等方法［１５－１７］。相比于其他方法，固相萃取具有耗时短、消耗溶剂少、操作简便等优点，可以高效提取样品中的ＢＤＥ－２０９。ＢＤＥ－２０９的检测方法主要有高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）和气相色谱－质谱联用法（ＧＣ－ＭＳ），其中ＧＣ－ＭＳ的离子源多采用ＮＣＩ源［１８］，而采用ＥＩ源的ＧＣ－ＭＳ不能检测高溴代联苯醚，例如ＢＤＥ－２０９。

本研究采用微生物法对ＢＤＥ－２０９进行降解，并采用固相萃取法（Ｃ１８固相萃取小柱）和ＨＰＬＣ法对降解体系中的ＢＤＥ－２０９进行提取和检测。试验过程中对ＨＰＬＣ的检测条件进行了优化，同时考察了不同溶剂对ＢＤＥ－２０９的萃取效率，为水相中高浓度ＢＤＥ－２０９的提取和检测提供一定的理论依据及基础。

１ 材料与方法

１．１ 试验材料

１．１．１ 试剂 二甲亚砜（ＡＲ级），二氯甲烷（ＡＲ级），正己烷（ＡＲ级），四氢呋喃（ＡＲ级），甲醇（ＨＰＬＣ级），乙腈（ＨＰＬＣ级），均购自上海凌峰化学试剂有限公司；ＢＤＥ－２０９（纯度９９％，百灵威科技有限公司）。ＢＤＥ－２０９储备液：以二甲亚砜为溶剂配成浓度为１ ０００ ｍｇ／Ｌ的ＢＤＥ－２０９储备液。ＢＤＥ－２０９标准溶液：以二甲亚砜为溶剂将ＢＤＥ－２０９储备液稀释成浓度为１００ ｍｇ／Ｌ的ＢＤＥ－２０９标准溶液。将无水硫酸钠置于马弗炉中于４５０ ℃下烘４ ｈ以上，稍冷后放入干燥器中冷却，密封保存，备用。

１．１．２ 培养基 ①ＬＢ液体培养基：鱼粉蛋白胨１０ ｇ、酵母粉５ ｇ、氯化钠５ ｇ、去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０。②ＬＢ固体培养基：向ＬＢ液体培养基中加入２％的琼脂即可。③无机盐培养基（ＭＳＭ）：ＫＨ２ＰＯ４ ２．６５ ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ４．２６ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ、ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ０．０２ ｇ、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１４ ｇ、ＮＨ４Ｃｌ ０．５ ｇ、微量元素 １ ｍＬ；去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０。其中微量元素溶液组成为： ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ２．１ ｇ、 ＺｎＣｌ２ ０．０７ ｇ、 ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０．０３ ｇ、 ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０６ ｇ、 ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０．１９ ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４ ·４Ｈ２Ｏ ０．０２４ ｇ、 去离子水１ ０００ ｍＬ。

１．１．３ 菌株来源 试验中所用的长野雷夫松氏菌（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｈｉｎｓｈｕｅｎｓｉｓ，简称菌ＧＨ１０）系赵晓祥课题组筛选获得的能够降解高浓度ＢＤＥ－２０９的纯菌，其最佳生长条件为３０ ℃，ｐＨ ７．０，摇床转速１５０ ｒ／ｍｉｎ。

１．１．４ 加标样品 以ＢＤＥ－２０９浓度为５０ ｍｇ／Ｌ的无机盐培养基作为固相萃取的加标样品，无机盐培养基中接入８％灭活的菌ＧＨ１０。

１．１．５ 仪器 ＬＣ－２０ＡＴ型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配色谱柱（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ Ｃ１８，５ μｍ，２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，日本岛津公司）；ＴＳＢＥＱ－ＣＲ１０１２型固相萃取仪（上海Ａｎｐｅｌ科学仪器有限公司），固相萃取小柱Ｃ１８柱（ＨＣ－Ｃ１８，２００ ｍｇ／３ ｍＬ，上海Ａｎｐｅｌ科学仪器有限公司）；ＰＹＸ－ＤＨＳ-４００－ＢＳ型隔水式电热恒温培养箱（上海博泰实验设备有限公司）；ＳＰＨ－２１０２Ｃ型立式双层摇床（上海世平仪器设备有限公司）；ＴＵ－１８１０型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

１．２ 试验方法

１．２．１ 菌种的活化及菌悬液的制备 取１环保藏于甘油中的菌ＧＨ１０并直接在ＬＢ固体培养基上划线培养３ ｄ，然后挑取单菌落再一次划线培养３ ｄ，一共活化２次。最后挑取单菌落于ＬＢ培养基中培养４８ ｈ，此时菌ＧＨ１０处于对数期，然后取适量菌液于６ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心６ ｍｉｎ，收集菌体并用生理盐水洗涤菌体３次，以等体积的生理盐水重悬，即得菌悬液。

１．２．２ 高效液相色谱条件优化 采用ＨＰＬＣ法对ＢＤＥ－２０９（以四氢呋喃为溶剂）的检测条件进行优化，手动进样，进样量为２０ μＬ。①检测波长的选择。通过对ＢＤＥ－２０９进行紫外扫描，确定ＢＤＥ－２０９的ＨＰＬＣ检测波长；②流动相比例及流速的选择。依次选用甲醇－去离子水、乙腈－去离子水为流动相，比较两种洗脱剂在不同配比的情况下ＢＤＥ－２０９的色谱行为；选择好流动相后，改变流速以确定ＢＤＥ－２０９的出峰时间。

１．２．３ 固相萃取条件优化 ①洗脱剂种类的选择。ＢＤＥ－２０９介于非极性和极性之间，根据相似相溶原理，选择从非极性到极性５ 种不同的洗脱剂，即正己烷、正己烷／二氯甲烷（８∶２，Ｖ／Ｖ）、正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）、正己烷／二氯甲烷（２∶８，Ｖ／Ｖ）、二氯甲烷。ＢＤＥ－２０９的固相萃取过程为：先用２ ｍＬ二氯甲烷预洗Ｃ１８固相萃取小柱，于负压下抽干溶剂，再依次用３ ｍＬ甲醇和３ ｍＬ去离子水活化，活化过程要保持小柱床体材料湿润；然后将２ ｍＬ加标样品进行上样，之后用３ ｍＬ去离子水淋洗以去除吸附在床体的杂质，并于负压下抽真空，直至Ｃ１８小柱床体材料完全干燥；最后采用２、２、１ ｍＬ （共５ ｍＬ）不同极性的洗脱剂依次对目标化合物ＢＤＥ－２０９进行洗脱，收集洗脱液。最终洗脱液过无水硫酸钠去除水，经０．２２ μｍ有机滤膜过滤后进样检测。每种洗脱剂进行３次平行试验，重复２次。②洗脱剂体积的选择。分别用２、２、１ ｍＬ正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）对ＢＤＥ－２０９进行３次洗脱，并分别收集洗脱液，依次编号，分别计算各洗脱液的绝对回收率及洗脱率。进行３次平行试验。

１．２．４ 菌ＧＨ１０对ＢＤＥ－２０９的降解 于２５０ ｍＬ锥形瓶中加入５ ｍＬ ＢＤＥ－２０９标准储备液，使得体系中ＢＤＥ－２０９的浓度为５０ ｍｇ／Ｌ。待二甲亚砜挥发后，加入无机盐培养基９２ ｍＬ，１２１ ℃下高压灭菌２５ ｍｉｎ。待培养基冷却到室温，接入ＧＨ１０菌悬液，接种量为８％。３０℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ摇床避光降解培养５ ｄ，每天各取样1次，每次取样２ ｍＬ，用２×２ ｍＬ二氯甲烷／正己烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）对培养基中残余的ＢＤＥ－２０９进行洗脱，合并洗脱液后立即进行ＨＰＬＣ检测。以接入灭活的菌悬液的无机盐培养基为空白对照，每一处理设３个平行，重复２次。

２ 结果与分析

２．１ 高效液相色谱条件优化

２．１．１ 检测波长的选择 ＢＤＥ－２０９的紫外扫描光谱曲线如图１所示。从图１中可以看出，在２６０ ～ ２８０ ｎｍ内，ＢＤＥ－２０９对紫外光都有较好的吸收。据研究，ＢＤＥ－２０９的ＨＰＬＣ的检测波长多选择２２６ ｎｍ和２６０ ｎｍ［１９］，本研究最终确定其检测波长为２６０ ｎｍ。

２．１．２ 柱温的选择 色谱柱的温度直接影响样品的分离效果，由于ＢＤＥ－２０９的紫外吸收较强，且较易洗脱，所以对温度的要求不太苛刻，因此本研究控制色谱柱的温度为３０ ℃。

２．１．３ 流动相的选择 当采用以乙腈／水（９５∶１０，Ｖ／Ｖ）为流动相，流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，在５６．２５ ｍｉｎ出现明显的ＢＤＥ－２０９色谱峰，但保留时间较长。增加有机相比例，即乙腈／水（９５∶５，Ｖ／Ｖ），流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，ＢＤＥ－２０９的出峰时间提前到３１．３６0 ｍｉｎ。在相同流速下，流动相改为甲醇／水（Ｖ／Ｖ）时，ＢＤＥ－２０９出峰时间延迟到４４．８６ ｍｉｎ。继续增加有机相比例，即乙腈∶水（９７∶３，Ｖ／Ｖ）为 ，流速保持为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，ＢＤＥ－２０９的出峰时间提前到２３．３０0 ｍｉｎ，但是峰的前段发生倾斜，且整个峰型不对称。当有机相比例保持在乙腈：水（９５∶５，Ｖ／Ｖ） 流速提高到１．２ ｍＬ／ｍｉｎ时，ＢＤＥ－２０９的出峰时间提前到２４．７０５ ｍｉｎ，而且峰型没有发生变化。试验结果表明，与甲醇／水体系相比，采用乙腈／水体系作为流动相，可以缩短ＢＤＥ－２０９的出峰时间；流速从１．０ ｍＬ／ｍｉｎ升高到１．２ ｍＬ／ｍｉｎ，不仅可以缩短出峰时间，而且还可以保证色谱峰的峰型。本研究最终选择乙腈／水（ ９５∶５，Ｖ／Ｖ）体系作为流动相，且乙腈／水流速为１．２ ｍＬ／ｍｉｎ，可以保证样品中的各成分有效分离，且色谱峰的峰型也较好，ＢＤＥ－２０９的保留时间为２４．７０５ ｍｉｎ，ＢＤＥ－２０９的ＨＰＬＣ色谱图如图２所示。

２．２ ＢＤＥ－２０９标准曲线

采用外标法定量。准确量取一定量的ＢＤＥ－２０９标准溶液，用二甲基亚砜配制成浓度为５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０ ｍｇ／Ｌ的ＢＤＥ－２０９溶液。采用ＨＰＬＣ法分别测定各个浓度的ＢＤＥ－２０９溶液，将测得的各浓度溶液相对应的峰面积（ｙ）随ＢＤＥ－２０９浓度（ｘ）作图，建立ＢＤＥ－２０９校准曲线，如图３所示。从图３中可以看出，ＢＤＥ－２０９在０～６０ ｍｇ／Ｌ内线性关系良好，R2为０．９９９ ７。标准曲线方程为ｙ＝１５．６６２ｘ－１．９５４ ２。

２．３ 固相萃取条件优化

２．３．１ 洗脱剂种类的选择 经过正己烷、正己烷／二氯甲烷（８∶２，Ｖ／Ｖ）、正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）、正己烷／二氯甲烷（２∶８，Ｖ／Ｖ）、二氯甲烷这５种不同极性的洗脱剂对ＢＤＥ－２０９进行洗脱，其洗脱效果见表１，从表１中可看出，正己烷对ＢＤＥ－２０９的洗脱效果最差，而其余４种洗脱剂均能较好地洗脱ＢＤＥ－２０９，其中正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）对ＢＤＥ－２０９的洗脱其回收率为９９．６１％，基本能够完全洗脱ＢＤＥ－２０９，选择正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）作为ＢＤＥ－２０９的洗脱剂。

２．３．２ 洗脱剂体积的选择 依次用２、２、１ ｍＬ正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ）对吸附在固相萃取柱中的ＢＤＥ－２０９进行洗脱，其洗脱效果见图４。由图４可见，目标化合物ＢＤＥ－２０９主要随第一个２ ｍＬ洗脱液ａ流出，９５．４２％的ＢＤＥ－２０９被洗脱掉，而洗脱液ｂ中仅含有微量的ＢＤＥ－２０９，洗脱液ｃ中已无目标化合物ＢＤＥ－２０９的流出。因此体积为２ ｍＬ×２的洗脱液已能将ＢＤＥ－２０９全部洗脱。

２．４ 菌ＧＨ１０对ＢＤＥ－２０９的降解

经过５ d的降解，在上述优化后的ＨＰＬＣ条件和固相萃取条件下，对微生物体系中的ＢＤＥ－２０９残留量进行测定，结果见图５。从图５中可看出试验的前３ ｄ培养液中的ＢＤＥ－２０９被菌ＧＨ１０快速降解消耗；第１天培养液中ＢＤＥ－２０９的浓度为４０．９３ ｍｇ／Ｌ，降解率比较低，这主要是因为第１天微生物处在一个适应环境的状态；第２天和第３天培养液中ＢＤＥ－２０９的浓度迅速降低，并且在第３天时培养液中ＢＤＥ－２０９的浓度最低，为２０．３８ ｍｇ／Ｌ，此时ＢＤＥ－２０９的降解率达到最高，为５９．２４％；第４ 天和第５天，培养液中的ＢＤＥ－２０９的浓度略微有些升高，可能是部分菌ＧＨ１０死亡使得体内未被分解的ＢＤＥ－２０９释放到培养液中导致的。因此，采用ＨＰＬＣ法和固相萃取法，能够高效检测微生物体系中ＢＤＥ－２０９的含量，同时可知菌ＧＨ１０在３ ｄ内能够快速降解ＢＤＥ－２０９。

３ 小结与讨论

３．１ 高效液相色谱条件优化结果

ＢＤＥ－２０９的高效液相色谱检测条件为：①根据ＢＤＥ－２０９的紫外扫描光谱曲线，确定ＢＤＥ－２０９的检测波长为２６０ ｎｍ；②ＢＤＥ－２０９的紫外吸收较强，并且比较容易从色谱柱上洗脱下来，因此温度对ＢＤＥ－２０９ 的检测影响不大，选择３０ ℃作为ＢＤＥ－２０９的检测温度；③流动相种类、比例和流速均能影响ＢＤＥ－２０９的出峰时间和峰形，当流动相为乙腈／水（９５∶５，Ｖ／Ｖ＝）以及流速为１．２ ｍＬ／ｍｉｎ时， ＢＤＥ－２０９不仅能够提前出峰，而且峰形也比较好，其出峰时间为２４．７０５ ｍｉｎ。

３．２ 固相萃取条件优化结果

ＢＤＥ－２０９是一种介于中等极性的有机物，因此与ＢＤＥ－２０９极性相似的洗脱剂能够完全将其从固相萃取柱中洗脱出来，ＢＤＥ－２０９的最佳洗脱剂为正己烷／二氯甲烷（１∶１，Ｖ／Ｖ），最佳洗脱体积为４ ｍＬ（２ ｍＬ×２），洗脱回收率为９９．６１％，ＲＳＤ为２．８４％。

３．３ 菌ＧＨ１０对ＢＤＥ－２０９的降解效果

菌ＧＨ１０是一种能够有效降解高浓度ＢＤＥ－２０９的微生物，经过５ d的培养， ＢＤＥ－２０９被菌ＧＨ１０降解。采用固相萃取和高效液相色谱法对该降解体系中的ＢＤＥ－２０９进行提取和检测，第３天降解体系中ＢＤＥ－２０９的残留浓度最低，降解率为５９．２４％；第４天和第５天菌ＧＨ１０部分死亡使得菌体内未被分解的ＢＤＥ－２０９释放到培养液中，导致体系中ＢＤＥ－２０９的浓度略有上升。通过固相萃取和高效液相色谱法能够快速提取和检测微生物降解体系中ＢＤＥ－２０９的含量，对水相中ＢＤＥ－２０９的检测提供一些实践基础和理论意义。

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（责任编辑 胡西洲）