DNA载体—聚DEAE葡聚糖和κ-卡拉胶微囊制备的可行性分析

于满昌，刘 丽，金璐娟，王 东，孙英杰，黄小丹

（黑龙江职业学院 150111）

摘要：DNA疫苗是一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统，被称为DNA免疫。研制高效的 DNA 疫苗载体，提高 DNA 疫苗转染效率，降低给药剂量是DNA 疫苗研究中亟需攻克的难题。本文对国内外相关研究分析得出聚DEAE?葡聚糖和κ?卡拉胶微囊作为DNA疫苗载体是可行的。

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关键词 ：DNA载体；聚DEAE葡聚糖；κ?卡拉胶；微囊

DNA疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，已成为疫苗研究领域中的热点之一，自上世纪90年代以来，DNA 疫苗因其良好的安全性及可诱导广泛的体液免疫和细胞免疫，越来越受到人们的关注。美国FAD已批准乙肝疫苗等10余种DNA疫苗进入临床试验，这预示DNA疫苗在21世纪将成为人类和动物与各种疾病抗争的有利武器，也显示出DNA疫苗的巨大潜力和应用前景。现已有马西尼罗河病毒、鲑鱼传染性出血性坏死病毒、犬黑色素瘤等三种 DNA 疫苗获准上市，DNA疫苗在传染病及肿瘤性疾病防治等领域发挥重要作用。DNA 疫苗进入机体后，利用宿主细胞表达系统合成相应抗原蛋白，并诱导机体产生免疫应答。因此，无论是制备DNA疫苗，还是进行基因治疗，都要求将DNA转染到细胞中。但多数DNA疫苗是水溶液注射剂，通过肌肉注射方式给药。一般情况下，裸DNA仅有0.1%~0.2% 被动物细胞吸收，绝大部分被核酸酶降解，并且裸DNA被肌细胞，特别是抗原提呈细胞摄取的效率极低，免疫效果很不理想。目前，研制高效的 DNA 疫苗载体，提高 DNA 疫苗转染效率，降低给药剂量是DNA 疫苗研究中亟需攻克的难题。

DNA疫苗是一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统，被称为DNA免疫。DNA疫苗由抗原编码基因及载体两部分组成。DNA疫苗载体分为病毒和非病毒载体两大类。病毒载体如痘病毒、棒状病毒、α病毒、复制缺陷型腺病毒、疱疹病毒等，其优点是转染效率较高，但存在携载外源DNA容量有限、制备过程复杂等缺点，特别是在安全性方面具有潜在危险限制了其应用。而非病毒载体主要包括脂质体、人工合成聚合物和天然高分子等，具有安全性高、容量大和易制备等优点，但也存在生物相容性差、转染效率低、细胞毒性等问题。用生物可降解控释微囊作为基因疫苗载体，理论上可长时间保持表达基因的活性，从而减少基因疫苗的剂量。

DNA以物理形式包埋在微球中，一方面聚合物与细胞作用可促进DNA转染，另一方面，微囊能够非特异性激活巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞，增加这些细胞对微囊的摄取量，提高转运的靶向性和转运效率，从而提高抗原表达水平，提高免疫效果[1]。DNA疫苗微囊的粒径、疏水性、电荷性、降解特性等理化性质直接影响转运效率和免疫效果。目前DNA疫苗微囊制备，主要采用聚乳酸?羟基乙酸共聚物（PLGA）、壳聚糖、海藻酸钠等生物降解材料。PLGA生物相容性好，在体内最终降解为H2O和CO2。PLGA微球亲水性和混悬性好，释药较快。但PLGA不溶于水，与水溶性的DNA疫苗大分子亲和性差，因而微球制备中要用有机溶剂和高速剪切分散药物，对药物的稳定性不利。海藻酸钠为天然多糖类阴离子高分子材料，制备条件温和，不需要有机溶剂，对DNA疫苗的稳定性十分有利；海藻酸钠微球的缺点是稳定性不够好，放置在磷酸盐缓冲液中，可因钠离子与钙离子的交换致使微球破裂。壳聚糖为天然来源多糖类阳离子高分子材料，其优点与海藻酸钠相似；壳聚糖一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中，由于pH值较低，DNA疫苗容易在制备过程中降解。因而开发和采用水溶性好、转染效率高、制备工艺稳定、可与细胞相互作用的可降解聚合物作为微囊材料是十分必要的。

喷雾干燥法、复乳?溶剂挥发法为制备DNA微球的常用方法，在制备过程中都需要超声、高速搅拌等措施将DNA分散到有机溶液中，会造成一定程度DNA的降解。Briones等用嗅化十六烷基三甲铵等阳离子乳化剂溶液为分散介质，采用复乳?溶剂挥发法制备空白阳性微球，然后吸附DNA疫苗，制成载药的阳性微球。这样可以避免DNA疫苗在制备过程中的降解。表面吸附DNA疫苗的阳性微球仍具有一定的保护作用，并能延长基因表达、提高免疫效果，但是存在于微球表面DNA会在体内降解。因此，简化制备DNA微囊工艺，且增加微囊内的DNA容量，也是DNA疫苗微囊制备的关键技术。CaCO3对DNA具有很好的吸附性，广泛用于DNA的回收；而CaCO3微粒具有多孔、表面积大的特点，进一步提高对DNA的吸附性能，形成的均一的CaCO3?DNA微粒利于包被成微囊。

在基因传递的各类聚合物中，多聚糖是被公认的最具潜力的DNA载体，具有天然、无毒、良好的生物降解性及生物相容性等特点。其中DEAE?葡聚糖促使哺乳动物细胞捕获外源DNA已经被证实，其机理还不明确，有人认为DEAE?葡聚糖同DNA结合成复合物，可以保护DNA免受核酸酶的降解作用；还有人认为DEAE?葡聚糖可以同细胞膜发生作用，从而使DNA容易穿过细胞表面而进入细胞内。因而以DEAE?葡聚糖包被DNA，提高转染效率是可行的。但是DEAE?葡聚糖如何在CaCO3?DNA微粒表面形成稳定囊膜，目前还未见报道。

有研究表明，在卡拉胶与葡聚糖具有表现出极好的相容性。在卡拉胶?葡聚糖混合体系中，葡聚糖的存在不妨碍卡拉胶有序结构的形成，反而增强了体系网络结构的稳定性[2]。葡聚糖由于其极细的粒度，高度的持水性与分散性，均匀填充至卡拉胶所成的有序网络结构中，以弱作用力与构成网络的卡拉胶分子链结合，维系了网络结构。卡拉胶是一种硫酸半乳聚糖，体外实验证明其对正常细胞无不良影响，具有广谱抗被膜病毒（单纯疱疹病毒、流感病毒、非洲猪瘟病毒、艾滋病病毒等）活性。有专家将硫酸化多糖?卡拉胶与人乳头瘤病毒16（HPV?16）E7肽疫苗联合，能产生抗原特异性反应和抗肿瘤效果，借助TLR4活化途径，可见卡拉胶还具有一定的免疫刺激功能。

终上所述，DEAE?葡聚糖和κ?卡拉胶作为DNA疫苗载体是可行的。

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参考文献：

[1]（宋健，陈磊，李效军，等.微胶囊化技术及应用[M].北京:化学工业出版社，2004.）

[2]　 （Van de velde F.，De Ruiter G A.，Polysaccharide II Polysaccharides from Eukaryotes[M]. Weinheim:Wiley-VCH. 2002.）