牛沙门氏菌病的实验室诊断

吕学思

（黑龙江省青年农场 150050）

牛的沙门氏菌病比较严重，尤其是犊牛，可引起很高的发病率和死亡率。沙门氏菌病的临床症状和剖检变化没有特异性，虽然可作为初步诊断的依据，但必须通过走患病动物进行病原菌分离或尸体剖检做出确诊。

1 活菌计数

有肠炎症状的发病动物粪便排出大量病原菌，应进行活菌计数而非增菌培养。正因如此，应采取粪便样品而不是棉拭子取样，应在使用抗生素之前采样。从口腔分泌物和血样中也可能分到细菌，但这些样品的可靠性不如粪便培养，并且操作中必须严格防止污染。死于沙门氏菌病的动物组织中含有大量的沙门氏菌，脾脏、肝脏以及肝、纵膈和支气管的淋巴结细菌数量可超过106个/g。从回肠、盲肠、结肠壁和内容物以及相关淋巴结细菌量与此相近。样品应取自肠和其他内脏器官，以区别于死于肠炎而无败血症的动物。流产动物应采取胎儿内容物、阴道黏液和胚胎绒毛叶样本同样活菌计数的结果比较可靠，因感染都柏林沙门氏菌而引起流产的动物的胚胎绒毛叶含菌量通常在108~1010个/g。通过细菌学检查检验带菌者比较困难，必须采取一种能区分“主动”带菌者（持续排菌）和“被动”或“蓄伏携带者”（间歇排菌）的方法。在区分“主动”带菌者方面，粪便样品比拭子样品更可靠一些，粪样中沙门氏菌含量通常超过105个/g。一次分离到沙门氏菌并不能判定动物是带菌者，只有至少3次粪样检测均阴性才可以判断未感染，即便是这样，一些“潜在携带者”和一些最终能清除感染但仍带菌的动物还会被漏检。分娩牛中采样有一定的优势，但也必须小心区分“被动携带者”。传统方法是在屠宰时从膀胱、胆汁中采样来确定带菌者。然而，这些样品中并非总是含有沙门氏菌，除非同时并发肝片吸虫病，还应对消化道内容物和表皮淋巴结等多个组织进行检测。当其他组织伪阴性时，还可从瓣胃壁、皱胃壁、瘤胃壁或支气管淋巴结、肩胛淋巴结、咽后淋巴结等处分离沙门氏菌。

2 细菌培养

一系列增菌技术和分离培养基可用于沙门氏菌的培养。这些培养基可选择性促进沙门氏菌生长，而抑制杂菌生长，根据菌落形态和生化反应对细菌进行鉴定。培养基的选择取决于分离沙门氏菌的环境，常常也取决于沙门氏菌分离培养专业人员。通常需要有多种液体增菌培养基和至少两种的固体培养基才能保证大多数沙门氏菌血清型的分离。增菌培养基能满足沙门氏菌生长的需要，但为了抑制其他杂菌的生长，需在培养基中加入化学物质、染料、抗生素和提高培养温度。通常使用的培养基中都含有亚硒酸钠、联四硫酸盐和亮绿、孔雀石绿等染料，沙门氏菌对这些物质相对具有一定的抗性。

3 细菌鉴定

在经液体培养增菌后，可在固体选择培养基上分离到沙门氏菌菌落，常用的选择培养基有麦康凯琼脂、亮绿琼脂、去氧胆酸枸橼酸琼脂、EF-18、铋亚硫酸盐和沙门氏菌-志贺氏琼脂。这些培养基是基于沙门氏菌对多种抗生素、胆盐和染料具有一定的抗性，对其他杂菌有抑制作用，沙门氏菌菌落均不发酵乳糖和蔗糖，这点可与其他细菌相区别。近来有一些新技术用于沙门氏菌的诊断，包括免疫磁性分离技术（IMS）、PCR或荧光PCR技术，但这些技术目前还只限于一些研究机构使用。一旦分离到沙门氏菌，可通过生化反应鉴定到菌属，有许多快速试剂盒可进行此类鉴定。可利用玻片和试管凝集试验鉴定血清型。既然需要大量的血清型，这就需要各地实验室的共同努力。

4 血清型分类

诸如鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等重要血清型可进一步分类，常用的方法有噬菌体分型（鼠伤寒沙门氏菌有200种以上的噬菌体型，我国通常有20~30种存在，但在任何时候都只有一两种噬菌体型占主导地位）、质粒分析和一系列分子技术，包括核糖体分型技术（rRNA基因限制性酶切图谱）、PFGE（脉冲场电泳）、IS200分型（与针对沙门氏菌一个独特的插入序列（IS200）的探针杂交后比较DNA限制性酶切图谱）、DNA指纹分析技术（RP：限制片段长度多态性）和AP（扩增片段长度多态性分析）等。