鸡群血凝抑制抗体水平快速测定法——β-微量法

吴佳宁?

（沈阳市动物疫病预防控制中心 110000）

近年来养鸡业有较快发展。但由于免疫失时，免疫不当和疫苗失效等多种原因致使鸡新城疫仍有流行，一些免疫力低落的鸡群，遇野外强毒侵袭时，有的引起急性暴发招致大批死亡，有的造成隐性感染而使野毒继续潜留。这不仅给广大农户带来损失也威胁着养鸡业的进一步发展。血凝抑制（HI）试验比中和试验简单、方便。且HI抗体水平与攻毒保护有密切关系。?

1 器材?

塑料微孔板：96孔V型凝集板，使用前后充分清洗，晾干。针管定量稀释器：以4支全量0.25mL的注射器并联制成，可以定量，前端接塑料滴头，每挤一下为0.05mL。一次可同时稀释4个样品。然后更换干净的滴头再用。微型振荡器：专用于微量凝集后的混合。也可用手振荡混合。塑料采血管：内径2mL的聚乙稀塑料管，剪成10～12cm，备用。标准滴管：以静脉注射管连接磨去尖端的18G号针头，要求每滴0.025mL。?

2 试剂?

磷酸缓冲盐水（PBS），用作稀释液。高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存，用时作20倍稀释。浓缩抗原：以含有Lasota系病毒的尿囊液经福尔马林灭灭，聚乙二醇浓缩制成，其血凝价为5000～16000，用聚乙烯塑料管小剂量分装，置4℃冰箱保存备用。（可在4℃下保存10个月以上，效价不变）。此抗原具有效价高、洗脱慢、耐长期保存和不散毒等优点，每次作血凝抑制试验按固定比例稀释配制4个血凝单位浓度的抗原，抗原稀释倍数按下式计算：（稀释倍数=血凝效价/血凝单位数）红血球悬液，采成年鸡血放入有8%柠檬酸钠抗凝剂的试管中或等量Alsever液中（后者可在4℃下保存2周），用20倍量的PBS洗涤血球，重复3～4次。每次2000转、分离心5分钟，最后一次离心10分钟，吸取压积血球，用PBS配成0.5%悬液，或先配成10%浓悬液（可在4℃下保存2～3天）用时进行20倍稀释。标准阳性血清：采自高度免疫的公鸡，经效价测定后分装小瓶，且在瓶签上标明HI价，0℃冰箱存放待用。待检血清：检测鸡群免疫水平时，每群随机采血20～30份血样，先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6～8cm长度。在酒精灯上将管一端烧融封口，或用石蜡封口，用胶布标明鸡号或群号，置37℃温箱中．2小时，待凝固拆出血清后以1000转／min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，如需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去。滴融化石腊封口，冻存于0℃冰箱内，用这种方法采血简易、快速、对鸡损伤小，尤适于雏鸡采血，也便于采血后携带，存放和分离血清。?

3 试验操作?

微量血凝（HA）试验。用定量稀释器于每孔中加PBS0.05mL，共滴4排孔。以稀释器吸1：5稀释抗原于第一列孔，挤压4～6次混匀后吸至经二列孔，依次倍比稀释，最后一列不加抗原作为对照。 换去稀释器前端塑料管头，再吸0.5%红血球悬液依次加入各孔，每孔0.05mL。置微型振荡器上振荡1分钟，或以手平持血凝板绕圆圈混匀。置室温下（?18～?20℃）30～40分钟，根据血球凝集图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度，如用2为底的对数表示，则1代表第1个稀释度（5×21），2代表第2个稀度（5×22），依次类推，其血凝滴度恰与板上出现完全凝集的最高孔数一致，（为精确比较不同抗原的血凝滴度，可将最高凝集孔后一孔的不全凝集状态：25%、50%、75%的凝集分别以对数0.25、0.5、0.75表示，作为前面整数的尾数）。每次做4个重复以几何均值表示结果。?

β-微量HI试验。在96孔V型微孔板上进行，用针管定量稀释器加样和稀释，一次可同时稀释四个样品。先取PBS0.05mL，放入第一孔和第12孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3～11孔，每孔0.05mL，第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原0.05mL。用稀释器吸待检血清0.05mL于第一孔中（血清对照）挤压混匀后吸0．05mL于第二孔依次倍比稀释至第十一孔，最后弃去0.05mL。置室温（18～20℃）下作用20min。用稀释器滴加?0.5%?红血球悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置30～40min，判定结果。以完全抑制血球凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，如用以2为底的对数（Log2）表示，其HI滴度恰与板上出现完全抑制的最高孔数一致。