子宫内膜腺癌雌激素受体亚型的表达及其与临床病理的方式分析
2022-06-08
[摘要] 目的 探讨雌激素受体α（ERα）、ERβ在子宫内膜样腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。 方法 选择2011年1月～2012年12月在广西医科大学附属肿瘤医院经组织学证实的93例子宫内膜腺癌（子宫内膜癌组）及31例正常子宫内膜（对照组）组织，分别采用qRT-PCR及免疫组化法检测ERα、ERβ mRNA及蛋白的表达情况。 结果 子宫内膜癌组ERα mRNA 表达量及蛋白阳性表达率、ERα/ERβ mRNA均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；随着临床分期、组织学分级、肌层浸润加深，ERα mRNA表达量、蛋白阳性表达率及ERα/ERβ mRNA比值逐渐下降（P < 0.05或P < 0.01）；子宫内膜癌组ERβ mRNA及蛋白表达也降低，与对照组比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。子宫内膜癌组织中ERα与ERβ阳性表达率呈负相关（r = -0.234，P < 0.05）。 结论 在子宫内膜癌的发生发展中，ERα的变化可能较ERβ更有意义，ERα/ERβ mRNA比值可作为判断子宫内膜癌预后的指标。
[关键词] 子宫内膜腺癌；雌激素受体α；雌激素受体β
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0087-04
子宫内膜癌被认为是一种激素依赖性肿瘤，雌激素受体（ER）、孕激素受体水平的改变与子宫内膜癌的发生发展及预后密切相关。本实验通过PCR技术及免疫组化检测子宫内膜癌中ERα、ERβ表达的变化，以探讨其与子宫内膜癌发生发展的关系及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年1月～2012年12月在广西医科大学附属肿瘤医院因子宫内膜癌手术治疗切除的子宫内膜组织93例（子宫内膜癌组），年龄33～76岁，中位年龄53岁，术前均无雌、孕激素使用史。术后经病理证实。手术病理分期按国际妇产科联盟2009年的标准：Ⅰ期55例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期4例。组织学分级：高分化45例，中分化28例，低分化20例。对照组选取因良性妇科肿瘤行子宫切除的正常子宫内膜31例，其中增生期21例，分泌期10例，年龄36～54岁，中位年龄48岁。
1.2 主要试剂
Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）购自美国Roche公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas公司，鼠抗人单克隆抗体ERα购自Santa Cruz公司，鼠抗人单克隆抗体ERβ购自GeneTex公司，免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 荧光定量PCR技术检测各组组织中ERα mRNA和ERβ mRNA的表达
Trizol法提取各组组织总RNA，利用RT-PCR试剂盒合成cDNA。ERα基因引物序列，上游：5'-TGCCAAGGAGACTCGCTAC-3'，下游：5'-CTTCGTAGCATTTGC GGAG-3'，扩增产物片段长度为209 bp；ERβ基因引物序列，上游：5'-GGTCCATCGCCAGTTATCACAT-3'，下游：5'-GATGCGTAATCGCTGC AGACAG-3'，扩增产物片段长度为227 bp；以GAPDH基因为内参照，其引物序列，上游：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTT C-3'，扩增产物片段长度为225 bp。PCR反应体系共20 μL，包括DNA荧光染料SYBR Green 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加水至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，35次循环。采用2-ΔΔCt法对数据进行相对定量分析。实验重复3次，取均值。
1.4 采用免疫组织化学SP法检测ERα蛋白和ERβ蛋白的表达
石蜡切片（厚4 μm）经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3 %双氧水封闭内源性过氧化物酶活性，室温浸泡，磷酸盐缓冲液（PBS）振洗后，分别以鼠抗人单克隆抗体ERα 1∶200、或ERβ 1∶200，4℃孵育过夜，过氧化物酶标志的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育，PBS振洗，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，树胶封片。每次实验均设立阳性及阴性对照，ER以已知阳性的乳腺癌切片作阳性对照，以PBS液代替一抗作阴性对照。
1.5 结果判定
ERα、ERβ蛋白阳性染色主要定位于细胞核，细胞核内有黄色或棕黄色颗粒分布者即为阳性细胞。每张切片在阳性表达较高区域随机选择5个高倍视野（400倍），每个视野至少计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占比例。
1.6 统计学方法
采用spss 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关系数；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ERα、ERβ mRNA及蛋白在正常内膜及子宫内膜癌组织中的表达
所有组织中均能检测到ERα、ERβ mRNA的表达。子宫内膜癌组中，ERα mRNA及蛋白的表达量明显下降，与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；ERβ mRNA及蛋白的表达量也降低，与对照组比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）；ERα/ERβ mRNA比值较对照组明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1、图1。 表1 两组子宫内膜组织中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表达
A、C：正常内膜；B、D：子宫内膜腺癌
图1 不同子宫内膜组织中ERα及ERβ的表达情况
（SP染色，100×）
2.2 子宫内膜癌中ERα、ERβ的表达与临床病理因素的关系
子宫内膜癌Ⅰ期、高分化、肌层浸润深度<1/2、淋巴结阴性的内膜组织中ERα mRNA的表达量、蛋白阳性表达率及ERα/ERβ mRNA比值均高于子宫内膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌层浸润>1/2、淋巴结阴性的内膜组织，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。子宫内膜癌Ⅰ期、高分化、肌层浸润深度<1/2、淋巴结阴性的内膜组织中ERβ mRNA的表达量及蛋白阳性表达率均低于子宫内膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌层浸润>1/2、淋巴结阴性的内膜组织，但差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表2。
表2 不同内膜癌组织中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表达情况
2.3 ERα与ERβ在子宫内膜癌中表达的关系
在子宫内膜腺癌中，55例ERα 蛋白表达阳性的病例中，ERα与ERβ在子宫内膜癌组织中阳性表达率呈负相关 （r=-0.234，P < 0.05）。见表3。
表3 子宫内膜癌中ERα与ERβ的关系（例）
3 讨论
一般认为子宫内膜癌的发生与雌激素刺激有关，而雌激素主要通过雌激素受体发挥作用，是一类由配体激活的转录因子。经典的雌激素受体有ERα和ERβ两种亚型，具有高度同源性，ERα基因位于染色体6q24，而ERβ 基因则位于14q22～24，两者组织分布不一，与配体结合特性不同，提示它们可能具有不同的生物学作用[1]。
ER与配体结合后发生构象变化，ERα和ERβ形成同源或异源二聚体，参与靶器官、组织的增殖和分化的调控。有研究表明[2-3]，子宫内膜组织从正常内膜、增生内膜到内膜癌，ERα和ERβ的表达逐渐减少，说明ERα和ERβ均参与子宫内膜癌的发生[4-5]。ERα mRNA的表达从正常组织或肿瘤G1到G3逐渐降低，ERα蛋白具有同样的变化，ERβ mRNA和蛋白均无变化，结果表明ERα在子宫内膜表达下调可能与肿瘤的发生有关[6]。本研究结果显示，ERα mRNA表达量及蛋白阳性表达率在正常内膜、内膜癌组织中的表达呈明显下降趋势，ERβ mRNA及蛋白表达亦明显下降，表明ER两种亚型表达改变在致癌过程中都起作用，引起的信号传导通路与它们的相互作用发生改变有关，但ERα表达在内膜癌中的变化显著高于ERβ，提示ERα表达的下调或缺失在内膜癌的发生中起到重要的作用[5，7]，而ERβ可能起调节作用，通过影响癌基因来促进子宫内膜癌的发生[8]。
Wilde等[9]研究发现，子宫内膜癌患者在接受他莫昔芬治疗过程中，由于他莫昔芬的抗雌激素作用，ERα的表达下调，推测雌激素主要通过ERα起作用，癌变到一定程度后对雌激素的反应改变，ERα表达下降。本研究结果显示，ERα的表达率随着分期的升高、分级的增加、肌层浸润深度的加重其下调更为显著，提示ERα表达下调与内膜癌的发展及浸润转移有关，与既往的研究[7，10]结果一致。高水平的ERα可抑制血管生成旁路而对子宫内膜癌有抑制作用[11]。ERα的低表达或缺失与上皮-间质细胞的恶性转化及不良预后呈正相关[12]，ERα的表达状态可能提供了不依赖于子宫内膜癌分期与分级的预后影响因素[13]。
ERβ在子宫内膜癌发病机制中的作用研究较少，且其表达具有一定的差异性。有研究发现，ERβ在晚期及淋巴结转移的患者中表达增加[14]。也有研究发现，癌组织中ERβ mRNA水平明显低于癌旁正常内膜组织[15]。Shabani等[16]的研究显示，ERβ的表达与内膜癌临床病理及预后无明显相关性。本研究中，ERβ mRNA的表达量及蛋白阳性表达率在Ⅰ期与Ⅱ～Ⅳ期、组织学分化程度、淋巴结阴性与阳性、肌层浸润深度之间的表达差异虽无统计学意义，但均呈增加趋势，提示ERβ mRNA的相对高表达在子宫内膜癌变中具有一定的作用，可能与预后不良有关[14，17]。
在许多研究中，子宫内膜癌的恶性转化与ERα/ERβ mRNA比值下降有关[14，18]。本研究中，ERα/ERβ mRNA比值与临床分期、组织学分级及肌层浸润深度有关，ERα与ERβ在子宫内膜癌组织中阳性表达率呈负相关，说明两者比例的改变与ERα水平下降和/或ERβ上升有关。在子宫内膜恶变过程中存在ERα/ERβ mRNA比值的降低，这种改变可能归结于ERα的下调及ERβ的上调[10]，ERα/ERβ mRNA比值≤1是影响预后的独立因素，ERα和ERβ的表达失衡，尤其是ERα/ ERβ比值，较单一的ERα或ERβ，对评估患者预后可能更具优势[19]。研究还发现，17β雌二醇由ERα介导能激活转录，而ERβ介导则表现为抑制转录，推测ERα和ERβ在基因表达的调节方面各有分工，两者的比例可能决定细胞对雌激素的反应性[20]。本研究也发现，ERα/ERβ mRNA比值随着手术病理分期、组织学分级的升高和肌层浸润的加深而明显下降，说明ERα/ERβ mRNA比值的降低与患者的不良预后具有一定的相关性，可作为判断预后的指标。
综上所述，子宫内膜癌的预后评估可能需要共同分析ERα、ERβ而得到，两者的变化对内膜癌的发生发展的影响还需要进一步的研究。
[参考文献]
[1] Zwart W，de Leeuw R，Rondaij M，et al. The hinge region of the human estrogen receptor determines functional synergy between AF-1 and AF-2 in the quantitative response to estradiol and tamoxifen [J]. J Cell sci，2010，123（Pt8）：1253-1261.
[关键词] 子宫内膜腺癌；雌激素受体α；雌激素受体β
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0087-04
子宫内膜癌被认为是一种激素依赖性肿瘤，雌激素受体（ER）、孕激素受体水平的改变与子宫内膜癌的发生发展及预后密切相关。本实验通过PCR技术及免疫组化检测子宫内膜癌中ERα、ERβ表达的变化，以探讨其与子宫内膜癌发生发展的关系及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年1月～2012年12月在广西医科大学附属肿瘤医院因子宫内膜癌手术治疗切除的子宫内膜组织93例（子宫内膜癌组），年龄33～76岁，中位年龄53岁，术前均无雌、孕激素使用史。术后经病理证实。手术病理分期按国际妇产科联盟2009年的标准：Ⅰ期55例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期4例。组织学分级：高分化45例，中分化28例，低分化20例。对照组选取因良性妇科肿瘤行子宫切除的正常子宫内膜31例，其中增生期21例，分泌期10例，年龄36～54岁，中位年龄48岁。
1.2 主要试剂
Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）购自美国Roche公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas公司，鼠抗人单克隆抗体ERα购自Santa Cruz公司，鼠抗人单克隆抗体ERβ购自GeneTex公司，免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 荧光定量PCR技术检测各组组织中ERα mRNA和ERβ mRNA的表达
Trizol法提取各组组织总RNA，利用RT-PCR试剂盒合成cDNA。ERα基因引物序列，上游：5'-TGCCAAGGAGACTCGCTAC-3'，下游：5'-CTTCGTAGCATTTGC GGAG-3'，扩增产物片段长度为209 bp；ERβ基因引物序列，上游：5'-GGTCCATCGCCAGTTATCACAT-3'，下游：5'-GATGCGTAATCGCTGC AGACAG-3'，扩增产物片段长度为227 bp；以GAPDH基因为内参照，其引物序列，上游：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTT C-3'，扩增产物片段长度为225 bp。PCR反应体系共20 μL，包括DNA荧光染料SYBR Green 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加水至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，35次循环。采用2-ΔΔCt法对数据进行相对定量分析。实验重复3次，取均值。
1.4 采用免疫组织化学SP法检测ERα蛋白和ERβ蛋白的表达
石蜡切片（厚4 μm）经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3 %双氧水封闭内源性过氧化物酶活性，室温浸泡，磷酸盐缓冲液（PBS）振洗后，分别以鼠抗人单克隆抗体ERα 1∶200、或ERβ 1∶200，4℃孵育过夜，过氧化物酶标志的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育，PBS振洗，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，树胶封片。每次实验均设立阳性及阴性对照，ER以已知阳性的乳腺癌切片作阳性对照，以PBS液代替一抗作阴性对照。
1.5 结果判定
ERα、ERβ蛋白阳性染色主要定位于细胞核，细胞核内有黄色或棕黄色颗粒分布者即为阳性细胞。每张切片在阳性表达较高区域随机选择5个高倍视野（400倍），每个视野至少计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占比例。
1.6 统计学方法
采用spss 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关系数；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ERα、ERβ mRNA及蛋白在正常内膜及子宫内膜癌组织中的表达
所有组织中均能检测到ERα、ERβ mRNA的表达。子宫内膜癌组中，ERα mRNA及蛋白的表达量明显下降，与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；ERβ mRNA及蛋白的表达量也降低，与对照组比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）；ERα/ERβ mRNA比值较对照组明显下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1、图1。 表1 两组子宫内膜组织中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表达
A、C：正常内膜；B、D：子宫内膜腺癌
图1 不同子宫内膜组织中ERα及ERβ的表达情况
（SP染色，100×）
2.2 子宫内膜癌中ERα、ERβ的表达与临床病理因素的关系
子宫内膜癌Ⅰ期、高分化、肌层浸润深度<1/2、淋巴结阴性的内膜组织中ERα mRNA的表达量、蛋白阳性表达率及ERα/ERβ mRNA比值均高于子宫内膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌层浸润>1/2、淋巴结阴性的内膜组织，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。子宫内膜癌Ⅰ期、高分化、肌层浸润深度<1/2、淋巴结阴性的内膜组织中ERβ mRNA的表达量及蛋白阳性表达率均低于子宫内膜癌Ⅱ～Ⅳ期、中低分、肌层浸润>1/2、淋巴结阴性的内膜组织，但差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表2。
表2 不同内膜癌组织中ERα、ERβ mRNA及蛋白的表达情况
2.3 ERα与ERβ在子宫内膜癌中表达的关系
在子宫内膜腺癌中，55例ERα 蛋白表达阳性的病例中，ERα与ERβ在子宫内膜癌组织中阳性表达率呈负相关 （r=-0.234，P < 0.05）。见表3。
表3 子宫内膜癌中ERα与ERβ的关系（例）
3 讨论
一般认为子宫内膜癌的发生与雌激素刺激有关，而雌激素主要通过雌激素受体发挥作用，是一类由配体激活的转录因子。经典的雌激素受体有ERα和ERβ两种亚型，具有高度同源性，ERα基因位于染色体6q24，而ERβ 基因则位于14q22～24，两者组织分布不一，与配体结合特性不同，提示它们可能具有不同的生物学作用[1]。
ER与配体结合后发生构象变化，ERα和ERβ形成同源或异源二聚体，参与靶器官、组织的增殖和分化的调控。有研究表明[2-3]，子宫内膜组织从正常内膜、增生内膜到内膜癌，ERα和ERβ的表达逐渐减少，说明ERα和ERβ均参与子宫内膜癌的发生[4-5]。ERα mRNA的表达从正常组织或肿瘤G1到G3逐渐降低，ERα蛋白具有同样的变化，ERβ mRNA和蛋白均无变化，结果表明ERα在子宫内膜表达下调可能与肿瘤的发生有关[6]。本研究结果显示，ERα mRNA表达量及蛋白阳性表达率在正常内膜、内膜癌组织中的表达呈明显下降趋势，ERβ mRNA及蛋白表达亦明显下降，表明ER两种亚型表达改变在致癌过程中都起作用，引起的信号传导通路与它们的相互作用发生改变有关，但ERα表达在内膜癌中的变化显著高于ERβ，提示ERα表达的下调或缺失在内膜癌的发生中起到重要的作用[5，7]，而ERβ可能起调节作用，通过影响癌基因来促进子宫内膜癌的发生[8]。
Wilde等[9]研究发现，子宫内膜癌患者在接受他莫昔芬治疗过程中，由于他莫昔芬的抗雌激素作用，ERα的表达下调，推测雌激素主要通过ERα起作用，癌变到一定程度后对雌激素的反应改变，ERα表达下降。本研究结果显示，ERα的表达率随着分期的升高、分级的增加、肌层浸润深度的加重其下调更为显著，提示ERα表达下调与内膜癌的发展及浸润转移有关，与既往的研究[7，10]结果一致。高水平的ERα可抑制血管生成旁路而对子宫内膜癌有抑制作用[11]。ERα的低表达或缺失与上皮-间质细胞的恶性转化及不良预后呈正相关[12]，ERα的表达状态可能提供了不依赖于子宫内膜癌分期与分级的预后影响因素[13]。
ERβ在子宫内膜癌发病机制中的作用研究较少，且其表达具有一定的差异性。有研究发现，ERβ在晚期及淋巴结转移的患者中表达增加[14]。也有研究发现，癌组织中ERβ mRNA水平明显低于癌旁正常内膜组织[15]。Shabani等[16]的研究显示，ERβ的表达与内膜癌临床病理及预后无明显相关性。本研究中，ERβ mRNA的表达量及蛋白阳性表达率在Ⅰ期与Ⅱ～Ⅳ期、组织学分化程度、淋巴结阴性与阳性、肌层浸润深度之间的表达差异虽无统计学意义，但均呈增加趋势，提示ERβ mRNA的相对高表达在子宫内膜癌变中具有一定的作用，可能与预后不良有关[14，17]。
在许多研究中，子宫内膜癌的恶性转化与ERα/ERβ mRNA比值下降有关[14，18]。本研究中，ERα/ERβ mRNA比值与临床分期、组织学分级及肌层浸润深度有关，ERα与ERβ在子宫内膜癌组织中阳性表达率呈负相关，说明两者比例的改变与ERα水平下降和/或ERβ上升有关。在子宫内膜恶变过程中存在ERα/ERβ mRNA比值的降低，这种改变可能归结于ERα的下调及ERβ的上调[10]，ERα/ERβ mRNA比值≤1是影响预后的独立因素，ERα和ERβ的表达失衡，尤其是ERα/ ERβ比值，较单一的ERα或ERβ，对评估患者预后可能更具优势[19]。研究还发现，17β雌二醇由ERα介导能激活转录，而ERβ介导则表现为抑制转录，推测ERα和ERβ在基因表达的调节方面各有分工，两者的比例可能决定细胞对雌激素的反应性[20]。本研究也发现，ERα/ERβ mRNA比值随着手术病理分期、组织学分级的升高和肌层浸润的加深而明显下降，说明ERα/ERβ mRNA比值的降低与患者的不良预后具有一定的相关性，可作为判断预后的指标。
综上所述，子宫内膜癌的预后评估可能需要共同分析ERα、ERβ而得到，两者的变化对内膜癌的发生发展的影响还需要进一步的研究。
[参考文献]
[1] Zwart W，de Leeuw R，Rondaij M，et al. The hinge region of the human estrogen receptor determines functional synergy between AF-1 and AF-2 in the quantitative response to estradiol and tamoxifen [J]. J Cell sci，2010，123（Pt8）：1253-1261.