替莫唑胺治疗脑胶质瘤患者HOXB9基因、多重耐药相关分子的表达与相关性

摘    要：目的 研究探讨对于脑胶质瘤患者进行替莫唑胺化疗与HOXB9基因以及多重耐药相关分子和耐药分子的相关表达情况的相关性。方法 选取我院在2016年7月至2021年7月所接收和治疗的经过化疗的脑胶质瘤患者共80例，之后按照患者是否对替莫唑胺产生耐药性分为耐药组以及非耐药组，两组各40例，之后对比两组患者的HOXB9基因以及相关的耐药因子的具体表达情况。主要包括：P糖蛋白（P-gP）、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）、人类mut-s同系物（hMLH）、人类mut-s同系物2(hMSH2)。结果 经过对比可知，耐药组的HOXB9以及P-gP、MGMT的阳性率为72.50%、77.50%、80.00%明显高于非耐药组的17.50%、20.00%、17.50%（χ2=24.444,P <0.05）,hMLH以及hMSH2的阴性率明显高于非耐药组（P <0.05）。经过对其进行耐药性回归分析可知，高表达率HOXB9基因可能是替莫唑胺化疗脑胶质瘤患者耐药的一个因素。结论 HOXB9基因与多个P-gp、MGMT、hMLH和hMSH2的分子密切相关，可能与脑胶质瘤患者对替莫唑胺的耐药有关。在治疗中可以实时检测患者的HOXB9的情况，若出现异常及时进行干预，可能有助于降低脑胶质瘤对替莫唑胺的耐药率。
关键词：替莫唑胺 脑胶质瘤 HOXB9 耐药分子 相关性

胶质瘤生长迅速，具有较强的侵袭性，手术治疗组织难度系数大，彻底清除病灶，许多药物难以进入血脑屏障，化疗药物长期使用后会出现耐药性，因此，即使是手术结合放疗和化疗的患者，也同时需要有效的治疗基础来提高化疗的整体治疗效果[1-2]。治疗脑胶质瘤的有效药物包括替莫唑胺，但患者可能因耐药性原因造成治疗效果低下。以往的研究表明，替莫唑胺的耐药与多药耐药蛋白有着紧密的联系。多药耐药主要表现为多药耐药相关分子的异常表达，如P-GP、MGMT、DNA错配修复（MMR）系统等[3-4]。h MLH和h MSH2基因是否稳定直接影响细胞的修复功能，而HOXB9在乳腺癌、肺癌等多种疾病中表达不同。在促进肿瘤发展以及凋亡中起重要作用[5-6]。因此，研究HOXB9基因在脑胶质瘤患者替莫唑胺化疗中的表达是否具有合成代谢作用，以及HOXB9基因的表达与替莫唑胺化疗耐药之间是否存在一定的相关性，具有重要的临床意义[7-8]。研究选取我院在2016年7月至2021年7月80例患者，观察脑胶质瘤化疗患者HOXB9基因表达与多药耐药相关分子及上述指标的关系。现将具体内容报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料
选取我院在2016年7月至2021年7月所接收治疗经过化疗的脑胶质瘤患者共80例，按照患者是否对替莫唑胺产生耐药性分别分为耐药组及非耐药组，两组各40例。耐药组中男21例，女19例，年龄在65～75岁，平均年龄（69.11±2.04）岁，非耐药组中男20例，女20例，年龄在66～77岁，平均年龄（69.14±2.02）岁。两组一般资料比较无明显差异（P>0.05）。且所有患者及家属均知晓此次研究。此次研究经过医院伦理会支持。纳入标准：(1)所有患者均经过磁共振成像确诊为脑胶质瘤。(2)所有患者术后均接受化疗。(3)所有患者病理组织为完全封闭状态。排除标准：(1)伴随远处转移。(2)伴随其他恶性肿瘤。(3)机体素质低，不能忍受化疗。(4)其他脏器功能障碍。
1.2 方法
所有仪器以及试剂：主要使用由中国科学院上海研究所生物化学与细胞生物学研究所提供的人恶性胶质瘤u251株；并且使用由Solarbio（美国）生产胎牛血清和DMEM，噻唑蓝（MTT）试剂盒选用碧盐田生物科技有限公司，Tranawall试验箱由康宁（美国）制造，从AB-CAM（美国）中筛选出兔抗HOXB9和抗人Ig G二级抗体，Prime Script由上海吉马制药技术有限公司负责完成。CDNA反转录试剂盒由北京康美有限公司提供，用于荧光定量PCR。ENVISIONTM兔和大鼠染色试剂盒、SYBR Premix Extaq TM II试剂盒和抗MGMT、HMSH2与HMLH多克隆抗体分别选自上海基因公司、北京康威之生物技术有限公司、武汉宝西。样品处理方法：所有样品固定、脱水、切片、包埋、染色。以上操作严格按照试剂、仪器、试剂盒说明书进行，全过程由专业人员进行，严格质量控制。
1.3 观察指标
(1)观察两组患者的H O X B 9基因、P-g P、MGMT、h MLH以及h MSH2的阳性率以及阴性率。其中HOXB9基因判定方法为：选择5个视野高功率场（细胞数>200）观察阳性细胞的染色强度，计算阳性细胞的占比。检测规则为：阳性染色信号为核内黄棕色颗粒，0为未染色，1为浅黄色，2为黄色，3为棕黄色；然后根据阳性细胞比例评分为0分（阳性细胞比例<5%）、1分（≥5%和<25%）、2分（≥25%和<50%）、3分（≥50%和<75%）和4分（≥75%）。相乘得最后分数，并根据最终分数计算着色程度。p-gp和mgmt检测方法分为阳性（胶质瘤细胞膜或细胞质可见棕色颗粒10%～30%）、强阳性（阳性细胞数≥30%）和阴性（阳性细胞少于10%）。HMLH和HMSH2通过随机抽取10个高倍视野区的400个脑胶质瘤细胞中阳性细胞的比例来测定的。阳性：肿瘤细胞可见棕黄色颗粒，阳性细胞比例≥25%；阴性：阳性细胞少于25%。在上述检测结果中，以阳性切片为对照，5%胎牛血清替代原代抗体为阴性对照。本研究以阳性和强阳性均为阳性。(2)使用回归分析HOXB9基因对于接受替莫唑胺化疗的患者的耐药性。
1.4 统计学方法
使用spss20.0软件进行处理，计数资料行χ2检验与Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXB9基因与多药耐药相关分子的表达
经过对比两患者的HOXB9基因与多药耐药相关分子的表达可知，耐药组的HOXB9以及P-g P、MGMT的阳性率明显高于非耐药组（P<0.05),h MLH以及h MSH2的阴性率明显高于非耐药组（P<0.05）。见表1。
表1 两组患者的HOXB9基因与多药耐药相关分子的表达比较[n(%)]

2.2 HOXB9基因对于接受替莫唑胺化疗的患者的耐药性回归分析
经过分析HOXB9基因对于接受替莫唑胺化疗的患者的耐药性可知，以接受替莫唑胺化疗的患者的耐药性为因变量，以HOXB9基因为自变量，经Logistic回归分析证实HOXB9可能是影响患者耐药的影响因素（P<0.05）。见表2。
表2 HOXB9基因对于接受替莫唑胺化疗患者的耐药性回归分析

3 讨论

胶质瘤抗性机制是复杂的、多层次的。尽管对耐药基因及其产物进行了许多临床研究，但在接受化疗的患者中，耐药基因与其耐药性之间的联系尚不清楚。研究脑胶质瘤患者的耐药性对于降低其耐药性和提高临床化疗效果至关重要[9-13]。研究表明，脑胶质瘤患者化疗耐药是多种因素综合作用的结果。胶质瘤患者化疗耐药的原因主要包括：(1)化疗对跨越屏障没有帮助。(2)少量胶质瘤药物积累。(3)加速许多化疗药物的解毒和代谢。(4)DNA损伤和修复的影响等。近年来，脑肿瘤化疗的临床研究进一步发展，HOXB9基因及多药耐药相关分子P-g P、MGMT、HM-LH、h MSH2等的表达产物与脑胶质瘤患者化疗耐药密切相关[14-17]。替莫唑胺含有大量咪唑嗪环，为首要化疗药物。它容易进入血脑屏障，引起细胞DNA烷基化，进而发挥毒性作用。其虽在一定程度上改善了患者预后，但疗效较差，尤其对复发患者，主要原因是患者对替莫唑胺的耐药增加。因此，探索一种有效逆转耐药的方法，对于提高该病患者的化疗疗效具有重要意义。
HOXB9基因属于HOX家族。研究表明HOX家族成员在参与胚胎生长、干细胞自我修复和再生以及组织重建等生理过程的同时，还与许多外来生物的生长和进化密切相关。此外，它们可以编码转录因子，调节它们之间的共同基因表达[18-20]。龙璐璐等[21]研究人员研究发现HOXB9基因是一种抑癌基因，HOXB9基因在甲状腺乳头癌的增殖中发挥着重要作用，可以成为治疗的新目标。这些结果表明HOXB9基因可能为治疗提供新的思路。
MGMT是DNA修复酶，可以帮助染色体避免化学物质造成的损伤，这些物质有助于治疗药物的细胞解毒。P-g P分布在细胞膜上具有分泌和分泌功能，其主要生理功能包括维持正常生理、激素和转化以及调节细胞功能。吞咽、呼吸代谢和药物解毒[22-24]。依赖能源的药物出口泵不仅在抗肿瘤药物的汇合点，而且在抗肿瘤药物的交配点。因此一旦P-g P和抗肿瘤药物结合起来，就可以通过ATP装置产生能量，ATP装置将致癌灶细胞泵出，并减少细胞中浓度改变，降低药物作用，产生一定的耐药性。其中h MLH和h MSH2是主要基因，对控制基因改变和保持功能的完整性十分重要。错误修复系统中的任何基因变化都可能导致细胞功能的丧失，使其错误复制或不稳定[25-27]。本研究结果提示HOXB9基因的表达可能与脑胶质瘤患者对替莫唑胺化疗产生耐药性有关。HOXB9基因的高阳性表达率可能是脑胶质瘤患者对替莫唑胺化疗耐药的一个影响因素。且该结果与Bai等[28]研究结果中HOXB9基因阳性率具有一致性。因此该病患者在应用替莫唑胺治疗前，可以及时、合理地干预HOXB9基因的非正常表达，以降低其对治疗的抵抗力。然而本研究中的样本很少，其结论缺乏临床证据证明。因此本项研究的可信度需要通过今后的进一步相关研究加以验证，以指导临床患者的化疗。
综上所述，HOXB9基因与MGMT、P-g P、h MSH2和h MLH密切相关，是胶质瘤患者采用替莫唑胺化疗后耐药的危险因素。建议在进行替莫唑胺化疗前，可对脑胶质瘤患者进行HOXB9基因表达监测，对于表达非正常的患者，及时进行针对性干预，有利于降低接受替莫唑胺化疗的脑胶质瘤患者的耐药率。

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