猪流行性腹泻的实验室诊断方法与疫苗研究进展

马子贵鲍玉芳何召庆/中国动物保健品有限公司

一、PED的实验室诊断方法

（一）病原学诊断

1.电镜观察法。由于PEDV和TGEV均属于冠状病毒，具有相似的形状和结构，故无法通过普通电镜观察进行区别，需通过免疫电镜法（IME）进行鉴别诊断。王继科等分别将抗原与抗体血清进行适当转速离心，再将其混合物离心后直接在电镜下观察，通过观察有无免疫复合物粒子团集结和堆积的现象从而对抗原进行鉴别区分。此方法具有简便，快速等特点，但因为该方法所用电镜设备价格昂贵，故在条件有限的一般实验室和养殖场中难以适用。

2.病毒分离培养。病毒的分离培养是将疑似感染PEDV的猪只病料经过处理后接种到Vero细胞上，并在显微镜下观察细胞有无病变。若接种后第2天观察细胞出现空斑、脱落等特征，即可做出初步诊断。但这种检测手段需结合其它手段，以保证结果可靠，另外此方法的操作程序繁杂，检测周期长，不适用于该病的快速诊断。

（二）血清学诊断

1.微量血清中和试验。微量血清中和试验运用病毒与血清中存在的抗体发生特异性结合从而失去了致病力的原理，将已知抗原分别与待检血清混合后接种到适应抗原生长的细胞上并设置对照组排除干扰，继而通过观察CPE进行鉴别诊断。

林志雄等建立了PED微量中和试验,该方法将已适应传代细胞生长的PEDV-G1株,与被检血清进行微量中和,接种到PK-15细胞作用48h然后测抗体。此试验方法操作步骤简便、结果易于判定，适宜推广使用。但由于测得血清中抗体不一定与防御有关，故阳性结果只能说明猪只接触了传染性病原微生物，所以该方法的鉴定结果有一定的不确定性。

1.免疫荧光法。免疫荧光法（IF）主要分为直接免疫荧光法（FAT）和间接免疫荧光法（IFAT），其中前者较为常用。崔现兰等用直接免疫荧光法对发病猪的小肠切片进行检测，结果显示对人工方法感染PEDV的仔猪检出率高于应用间接免疫荧光法和电镜观察法对PED阳性猪血清的检出阳性率。林志雄等用PEDV-G1株进行直接免疫荧光法测定6个猪场155份发病仔猪肠黏膜样品，结果检出率为52%，而且验证其不与其它引起猪腹泻症状的病原发生交叉反应，证明该方法特异性和准确性较高。

2.酶联免疫吸附试验（ELISA法）。ELISA法的特点在于检测样品的采集较为方便。在ELISA法原理的基础上目前发展出了间接ELISA、竞争阻断ELISA、双抗体夹心法ELISA以及Dot-ELISA法等诊断方法。

（1）间接ELISA。国外学者Oh等将其建立的间接ELISA法和病毒血清中和试验进行对比，结果显示间接ELISA方法的特异性和敏感性均较高，表明此方法适用于PEDV的检测。Ren等使用重组纯化的M蛋白免疫家兔产生相应抗体,建立了一种检测PEDV的间接ELISA方法。免疫荧光分析表明抗PEDV-M抗体与PEDV感染细胞发生反应且不与其它病毒发生交叉反应，证明该方法具有良好的敏感性与特异性。

（2）竞争阻断ELISA。此方法既可对抗原做定量的测定，也可对抗体进行检测。国外学者RodakL等利用制备得到的PEDVM蛋白单抗建立了竞争阻断ELISA诊断方法，试验结果表明竞争阻断ELISA具有较高的特异性和敏感性。Hou等将重组的PEDVN蛋白经大肠杆菌表达后提取，建立了一种检测血清中PEDV抗体的ELISA方法。

（3）双抗体夹心法ELISA。该法是检测抗原最常用的ELISA方法之一，适用于含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。雷利等用PEDV免疫蛋鸡后收获卵黄抗体，分离提纯后得到特异性抗体，建立了酶联免疫双抗夹心法检测方法。结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性，可作为快速检测猪流行性腹泻病毒的一种方法。朱维正等用双抗体ELISA法直接检测腹泻病猪粪便中的抗原并将检测结果与电镜结果对比，其阳性符合率为97.37%，阴性符合率为100%。

（4）Dot-ELISA法。该方法是常规ELISA方法在应用中逐渐发展出来的一种改进方法。新方法使得ELISA测定的特异性和灵敏度都有所提升，使ELISA检测操作更加简便和快速。陈茹等通过将PEDV抗原分离纯化,建立了斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测PEDV抗体,与琼脂扩散试验的检测结果进行对比显示，Dot-ELISA法更为敏感,特异性强而且重复性好。

（5）商品化检测产品。目前市场上商业化的PEDV检测试剂盒主要分为抗体检测试剂盒与抗原检测试剂盒。抗体检测试剂盒多用于非临床试验，如产品研发中的疫苗效果评价、某地区PEDV的流行病学检测，养猪场引种筛选检测等方面；抗原检测试剂盒多用于疫病诊断，将采集的猪粪病料进行定性临床测定。

（三）分子生物学诊断方法1.PCR技术诊断。

（1）多重PCR。猪流行性腹泻属于病毒性腹泻病,而常见造成猪腹泻的病毒还包括猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒。这三种疾病很难依靠临床诊断进行区分，解决这个问题的常用途径就是通过多重RTPCR技术进行诊断。张坤等分别根据PEDVM基因，TGEVN基因，GARVP7基因的基因序列设计相应引物，建立了一种可同时检测以上3种抗原的多重RT-PC方法；将此方法与常规RT-PCR手段进行比较后表明，该种多重RT-PCR方法敏感性和特异性均较高，是一种可行的鉴别诊断方法。

（2）荧光定量PCR。荧光定量PCR与传统的PCR方法相比操作步骤更简便，定量更准确且污染较小，有着很好的灵敏度和可重复性。刘邓等在PEDVN基因序列的基础上设计了一对特异性的引物和探针，并利用此探针建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明荧光定量PCR的阳性检出率为92%，高于常规RT-PCR检测结果。KimS-H等根据猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的特异核酸序列分别设计出相应的引物和探针，建立了多重实时荧光定量PCR方法可用于PEDV和TGEV的定量检测。

（3）巢式PCR。此方法利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应，这样做的目的在于减少错误扩增片段的产生量，所以应用巢式PCR方法获得的扩增产物特异性比较高。BenSalem等建立了多重巢式PCR用于检测可导致仔猪腹泻的PEDV、TGEV和PRV-A，其中能检测到的猪流行性腹泻病毒的RNA浓度为27.2μg/μl，可见巢式PCR检测有着很高的灵敏度。

霍金耀根据PEDVM的基因序列，分别设计合成针对M基因的内、外2对特异性引物，建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法，结果显示巢式RT-PCR方法能够快速且准确地检测出样本中微量的PEDV核酸。

（4）原位杂交技术。原位杂交技术用含有放射性或非放射性的外源核酸探针与样品中的待测DNA或RNA分子进行配对，再运用相应的检测手段显示出杂交分子的所在位置。OKim等用制备好的标记地高辛的核酸探针加入杂交缓冲液中，进行一系列处理后使其与组织切片中包含的PEDV相应基因发生碱基互补配对，在透射电镜下可观察到PEDV的遗传物质分布。

二、猪流行性腹泻疫苗的研究进展

1.猪流行性腹泻组织灭活苗。

1993年王明等用PEDV接种3～9日龄仔猪，然后采集发病仔猪的小肠组织和内容物，制成氢氧化铝灭活苗；将此疫苗经后海穴注射免疫仔猪，保护率可达85%。但组织灭活苗存在生产成本高，质量控制难度大的问题。

2.猪流行性腹泻细胞灭活苗。

马思奇等通过向病毒培养液中添加适量胰酶，使PEDV适应于Vero细胞，传代致弱后制成氢氧化铝灭活苗。此种方法制得的疫苗可用于PEDV疫情的预防和控制。但灭活苗存在产生免疫力需要周期长，不利于紧急预防接种的缺点。

3.猪流行性腹泻细胞弱毒苗。

佟有恩等通过对适应Vero细胞的CV777株传至第90代进行克隆纯化，得到独立稳定和良好免疫原性的弱毒株，制成弱毒苗免疫仔猪其被动保护率达到96.2%。另外商品化的弱毒疫苗还有日本的P-5V株和韩国的KPED-9株，DR13株等，其中DR13弱毒株在韩国应用于预防猪流行性腹泻的口服疫苗。

4.猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗。TGE-PED二联灭活苗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制，适用于疫情稳定的猪场（特别是种猪场），其主动免疫保护率为96%，被动免疫率为85.1%，免疫途径是后海穴注射，免疫后14天产生保护力。

5.猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗。佟有恩等研制的TGE-PED二联弱毒苗适合用于猪场的紧急预防接种，其主动免疫和被动免疫的保护力均能达到95%以上，注射7天后即产生免疫保护力。

6.猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗。目前由哈兽研研制的的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株）已经上市，活疫苗能同时诱导机体产生体液免疫与细胞免疫应答，可以用于紧急预防接种。

7.转基因植物疫苗。Kang等通过农杆菌介导蛋白转入法将PEDVS基因中的一段蛋白基因（称为COE基因）与合成的中和抗原表位基因一同导入烟草的基因中表达，表达得到的蛋白在转基因烟草总可溶性植物蛋白中分别为0.1%和2.1%。

该研究为以后的PEDV口服转基因植物疫苗的研制奠定了基础。

8.重组乳酸杆菌疫苗。葛俊伟等人先后成功构建了表达PEDVN基因和中和抗原表位基因的重组干酪乳杆菌，并免疫小鼠。研究结果显示重组菌既能诱导局部黏膜免疫应答，也能刺激机体引起特异性免疫应答。胡桂学等将导入了含PEDV纤突蛋白COE基因的重组乳酸杆菌口服免疫断奶仔猪，结果显示仔猪血清中的IgA和IgG含量明显上升。

以上研究为新型疫苗的研制提供了参考。

综上所述，开发针对PEDV的快速、准确且便于操作的实验室诊断技术对于PEDV的诊断与研究均具有重要意义；目前我国PED的防制措施主要依靠灭活疫苗和弱毒疫苗的应用，猪流行性腹泻具有发病急、发病日龄小以及死亡率高的特点，猪肠道的局部免疫反应系统在对PEDV的免疫应答中发挥重要的作用，所以能有效刺激机体黏膜和全身免疫应答的新型疫苗将是PEDV疫苗研发的一大趋势。