嗅鞘细胞移植和复方丹参联合治疗脊髓损伤的研究

钟波 肖红卫 王素伟 张爱莲

【摘要】目的 探讨嗅鞘细胞移植和复方丹参联合应用治疗脊髓损伤的可行性，为临床治疗提供实验基础。方法

制备脊髓损伤大鼠模型，按治疗方法分为4组：空白对照组（Control）、复方丹参组（SM）、嗅鞘细胞移植组（OECs）、复方丹参联合嗅鞘细胞移植组（OECs+SM）。术后动态评价各组大鼠运动功能，术后12周取材进行免疫组化和横截面甲苯胺蓝染色评价轴突再生情况。结果OECs+SM组术后12周BBB评分显著高于其他3组（p＜0.01）；OECs+SM组（11.2±1.03）%NF-200阳性表达显著高于其他3组（p＜0.05）；OECs+SM组的轴突密度为（14 359±903）/mm2，显著高于其他3组，差异具有统计学意义（p＜0.05）。

结论单独使用OECs或SM，均可产生部分神经纤维的修复，但联合使用OECs和SM，两者可以产生协同作用，效果明显优于单独使用。

【关键词】嗅鞘细胞移植 复方丹参 脊髓损伤

doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.12.006

脊髓损伤（Spinal Cord Injury，sci）是一种严重的临床常见疾病，多发生于交通事故及严重的创伤，可引起永久的瘫痪甚至死亡。SCI导致的截瘫处理及如何促进功能的恢复对临床医生来说仍是一项极大的挑战。在中枢神经系统继发性损害过程中，由于损伤组织缺血、缺氧的继发性病理改变，造成组织内氧自由基产生增加，清除能力下降导致氧自由基聚集。这种氧化应激（Oxidative Stress）能诱导神经细胞凋亡［1］，是造成中枢损伤后继发性病理损害的主要机制之一。

细胞治疗可以补充SCI造成的细胞损失，且可促进功能的恢复。嗅鞘细胞（Olfactory Eensheathing Cells，OECs）位于嗅球的外层，称为嗅觉神经层。当它由嗅上皮移行至嗅球时，同时将嗅神经进行了髓鞘包裹。移植到脊髓损伤部位后，OECs可以刺激受损的神经轴突再生，促进功能的恢复［2］，而丹参（Salvia Miltiorrhiza，SM）可有效清除脊髓损伤后血液和脊髓组织中的自由基［3］，改善神经纤维的修复环境。故笔者提出嗅鞘细胞移植和复方丹参联合使用治疗脊髓损伤的方法，并进行了初步研究，现报道如下。

1资料与方法

1.1OECs的分离、纯化和培养

①分离：OECs来自于嗅球外部的两层细胞，将2.5月龄SD雄性大鼠用断头法处死，嗅球保存在冷冻的Hank’s平衡盐溶液中，进行两次离心，做成含10%PBS的DMEM/F12培养基细胞悬浮液。将细胞用移液器吹打15~20次，然后过200目细胞筛，制备单细胞悬液。②根据OECs和成纤维细胞贴壁率不同进行OECs纯化：在培养12小时后，细胞悬液进行离心，加入20 μmol/l腺苷酸环化酶激活剂和20 μg/L牛脑垂体提取液（Bovine Pituitary Extract，BPE），12小时后，上清液和悬浮细胞转移至另一个涂有Poly-L-Lysine的培养皿中。培养2天后，加入1×10-5mol/L的胞嘧啶β-D-呋喃阿拉伯糖苷盐酸盐，培养24小时，PBS洗涤，含20 μmol/L腺苷酸环化酶激活剂和20 μg/L BPE的DMEM/F12培养基培养，2天更换1次。

1.2动物模型及分组

24只雄性SD大鼠随机分为4组：空白对照组（Control）、复方丹参组（SM）、嗅鞘细胞移植组（OECs）、复方丹参联合嗅鞘细胞移植组（OECs+SM），每组6只。5%水合氯醛（8 ml/kg）腹腔注射麻醉，手术显微镜下于8~10胸椎水平行椎板切除，清除皮肤和肌肉，显露脊髓，用手术刀在胸9水平统一从右侧造成3/4的脊髓损伤模型。造模的成功与否用Rivilin’s斜板试验进行验证，将合格的模型动物纳入研究。

1.3治疗方法

SCI造模成功7天后，按分组注射不同内容物。空白对照组：仅行造模，不作嗅鞘细胞移植和复方丹参治疗，腹腔注射生理盐水5 ml/次，2次/天，连续腹腔注射3周；复方丹参组：复方丹参注射液5 ml/次，2次/天，腹腔注射共3周；嗅鞘细胞移植组：采用嗅鞘细胞移植，利用显微注射器在胸9水平由头端和尾端（相距约0.5 mm）向损伤部位共注射5 μl OECs细胞悬液（1×109/ml），深度约为2 mm，注射完毕5分钟后拔出注射器；复方丹参联合嗅鞘细胞移植：嗅鞘移植移植同时并作腹腔丹参注射治疗3周。所有动物均饲养至造模后12周，取材。

1.4行为评估

在造模前、造模后1周及之后的每1周均由两名对分组不知情的研究者进行大鼠的Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分［4］，以评估其运动功能的恢复。

1.5免疫组化

造模12周后，将动物麻醉，开胸，主动脉插管，右心房切开，用pH=7.4的中性甲醛磷酸缓冲液灌注，当右心房溢出刺激性气味的液体2分钟后停止灌注。按造切口显露胸9平面，切取脊髓组织，标记损伤中心位置，用10%甲醛溶液4℃下浸泡24小时，含30%蔗糖的PBS浸泡过夜。以10 μm厚度冷冻切片，免疫组化法测定NF-200和S-100的含量，激光共聚焦扫描显微镜观察。

1.6横截面半薄切片甲苯胺蓝染色

上述灌注后，以2 mm厚度取脊髓损伤中心横截面切片。PBS洗涤3次，每次5分钟，然后以1%四氧化锇溶液4℃下固定2小时。PBS再次洗涤3次，不同浓度酒精脱水，固定于环氧树脂内，行半薄切片（0.5 μm）。1%甲苯胺蓝染色5分钟，依次洗涤、脱水，光镜观察。

1.7统计学处理

本次实验结果采用spss 13.0统计分析，所得结果记作（±s），组间比较采用方差分析（Bonferroni校正），p<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1OECs的纯化

OECs初始为粗短形，后变为细长形。因为脑膜和血管不可能完全除去，故镜下可见一定量的扁平的成纤维细胞（图1A）；纯化之后，OECs多为与雪旺细胞相类似的双极或多极的纺锤形，而星形胶质细胞样的煎蛋形很少（图1B）；S100β染色可以将OECs染成绿色（图1C），而成纤维细胞则不会染色。利用Image-Pro Plus软件计数10个随机视野中S100β阳性细胞，与纯化前相比，纯化后的OECs可以增加至（92.3±6.8）%，（p＜0.05），（图1D）。

2.2运动功能的恢复

Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分分为0~21分，0分为无功能，21分为功能正常［4］。4组动物的BBB评分如图2所示，6周时所有动物评分增长均趋于平缓，较为稳定，OECs+SM组评分平均为15.6，前后肢运动协调、步态稳定和偶尔的脚趾张开；术后12周时，OECs+SM组评分平均为17，运动时脚趾频繁张开；而其余3组的平均评分分别为空白对照组9.1，OECs组14.6，SM组13.2，显著低于OECs+SM组（p＜0.01）；OECs组和SM组评分显著高于空白对照组（p＜0.05）；尽管OECs组评分高于SM组，但差异并无统计学意义（p＞0.05）。

2.3轴突再生

图3A为4组大鼠脊髓取材后的大体观，OECs+SM组的修复效果最为理想；图3B三角所示为免疫组化切片所取的位置，距损伤中心2 mm（尾端）。

图3A ：4组动物术后12周脊髓取材大体照，比例尺：5 mm；B： 损伤中心及切片位置示意图，*，损伤中心，▲，免疫组化切片位置（损伤中心尾端2 mm）

NF-200染色结果见图4，空白对照组几乎没有阳性细胞的表达（图4A），OECs组和SM组可见部分阳性表达（图4B、C），OECs+SM组表达最为显著（图4D）。利用Image-Pro Plus软件随机取5个视野进行阳性细胞定量计数，结果见图4E，OECs+SM组（11.2±1.03）%显著高于其他3组（p＜0.05），这表明OECs+SM组再生神经纤维的数量高于其他3组。

横截面半薄切片甲苯胺蓝染色结果见图5，结果与NF-200染色相类似，空白对照组几乎没有再生轴突（图5A），OECs组和SM组可见部分轴突再生（图5B、C），而OECs+SM组显示在瘢痕组织中有大量的有髓鞘包裹的再生轴突（图5D）。统计结果见图5E，OECs+SM组的轴突密度为（14 359±903）/mm2，显著高于空白对照组（4 259±1 112）/mm2、OECs组（9 217±868）/mm2和SM组（6 852±751）/mm2，差异具有统计学意义（p＜0.05）。

3讨论

哺乳动物中枢神经系统轴突再生能力非常有限，一旦发生损伤，如何补充损伤的细胞和如何激活内源性细胞是治疗的关键。脊髓损伤可以造成皮质脊髓束的中断及受伤部位周围神经元细胞、星形胶质细胞和少突细胞的持续坏死，从而导致受伤平面以下的运动障碍［5］。初始损伤和继发坏死可以造成液化囊腔的出现和扩大，白质和灰质会持续减少。液化囊腔可以扩散到损伤周围的健康脊髓中，造成更大范围的细胞死亡，从而导致更严重的功能障碍［6］。

OECs是一种分布于嗅球和鼻粘膜中的独特的胶质细胞，它在成熟阶段仍可以继续生长，同时存在于中枢神经系统和周围神经系统［7］。基于抗原和形态学，可将OECs分为两种：①形态，具有雪旺细胞样功能；②煎蛋形态，具有星形胶质细胞样功能。已有报道表明OECs可以帮助新生轴突穿过胶质瘢痕，对修复脊髓神经纤维损伤也很有效［8］。但OECs的初代培养因为脑膜和血管的残留容易出现成纤维细胞污染，成纤维细胞生长比OECs要快，故如果不进行细胞纯化，最终培养出的细胞大部分为成纤维细胞。通过纯化，我们得到了高纯度的OECs。本次实验OECs的分离是通过颅内手术实现的，已有报道证实人的OECs可以通过鼻粘膜得到，为临床应用提供了良好的途径［9］。

尽管OECs促进轴突再生的具体机制尚不明确，但OECs确实分泌了很多有益的细胞因子，例如神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）、脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）、神经胶质细胞衍生神经营养因子（Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor，GDNF）等。此外，OECs还可分泌细胞外基质以促进轴突生长，例如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、IV型胶原［10］。OECs移植的最大优势可能在于它们可以侵入并通过胶质瘢痕，从而方便了轴突穿过受损部位而再生。已有临床报道OECs移植可以促进SCI患者的部分功能恢复［11］，我们的结果也证实了这一点。

复方丹参是一种具有广泛生物活性的中药，最近从复方丹参中分离出2-异丙基-8-甲基-菲3、4-二醇，其抗血小板凝集作用较罂粟碱强30倍；复方丹参能强有力地使纤维蛋白质原裂解为FDP减少纤溶酶原激活物的抑制物，加强纤溶，从而起到抗血栓作用；复方丹参还可提高红细胞的变形能力，降低血液粘稠度，增加脊髓伤区血流量［12］。我们的结果表明单独使用复方丹参，也有部分修复神经纤维的功能。

本研究结果表明，单独使用OECs或SM，均可产生部分神经纤维的修复，但联合使用OECs和SM，且效果明显优于单独使用，两者可以产生协同作用，但其作用的分子机制尚不明确，需进行进一步研究。

参考文献

［1］许翔，江疆．脊髓损伤后自由基变化及丹参对自由基影响和实验研究［J］．中国骨伤，1999，12（5）：16-18.

［2］ZHENG Z， LIU G， CHEN Y， et al. Olfactory ensheathing cell transplantation improves sympathetic skin responses in chronic spinal cord injury［J］. Neural Regen Res，2013，8（30）：2849-2855.

［3］马永刚，刘世清，彭吴，等．复方丹参对大鼠实验性脊髓损伤的保护作用［J］.山东中医药大学学报，2002，26（3）：216-218.

［4］BASSO DM， BEATTIE MS， BRESNAHAN JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］. J Neurotrauma，1995，12（1）：1-21.

［5］BEATTIE MS， FAROOQUI AA， BRESNAHAN JC. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury［J］. J Neurotrauma，2000，17（10）：915-925.

［6］RIBEIRO-SAMY S， SILVA NA， CORRELO VM， et al. Development and characterization of a PHB-HV-based 3D scaffold for a tissue engineering and cell-therapy combinatorial approach for spinal cord injury regeneration［J］. Macromol Biosci，2013，13（11）：1576-1592.

［7］PELLITTERI R， CATANIA MV， BONACCORSO CM， et al. Viability of olfactory ensheathing cells after hypoxia and serum deprivation： Implication for therapeutic transplantation［J］. J Neurosci Res，2014，92（12）：1757-1766.

［8］WU MM， FAN DG， TADMORI I， et al. Death of axotomized retinal ganglion cells delayed after intraoptic nerve transplantation of olfactory ensheathing cells in adult rats［J］. Cell Transplant，2010，19（2）：159-166.

［9］CHEN CR， KACHRAMANOGLOU C， LI D， et al. Anatomy and cellular constituents of the human olfactory mucosa： a review［J］. J Neurol Surg B Skull Base，2014，75（5）：293-300.

［10］LE BOURHIS M， RImbaUD S， GREBERT D， et al. Endothelin uncouples gap junctions in sustentacular cells and olfactory ensheathing cells of the olfactory mucosa［J］. Eur J Neurosci，2014，40（6）：2878-2887.

［11］TABAKOW P， RAISMAN G， FORTUNA W， et al. Functional regeneration of supraspinal connections in a patient with transected spinal cord following transplantation of bulbar olfactory ensheathing cells with peripheral nerve bridging［J］. Cell Transplant，2014 Oct 21. ［Epub ahead of print］

［12］CHAN，TY. Interaction between warfarin and danshen ［J］. Ann-Pharmacother，2001，35（4）：501-504.