葡萄糖酸钙锌颗粒微生物限度检查方法验证

王俊

贵州省食品药品检验所，贵州贵阳550004

【摘要】目的：建立葡萄糖酸钙锌颗粒微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版微生物限度检查法，采用平皿法对各试验菌的回收率逐一进行验证以建立细菌、霉菌和酵母菌计数方法；采用常规法进行控制菌大肠埃希菌的方法验证。结果：葡萄糖酸钙锌颗粒菌落计数采用常规平皿法验证时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉五株菌的回收率分别都是在70%以上，控制菌大肠埃希菌采用直接接种法时试验组能够检出试验菌。结论：葡萄糖酸钙锌颗粒的细菌计数方法可采用常规平皿法进行计数检测，霉菌及酵母菌计数方法可采用常规平皿法进行计数检测，控制菌大肠埃希菌可采用常规直接接种法进行检测。

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关键词 葡萄糖酸钙锌颗粒；微生物限度检查法；常规法

【中图分类号】R921.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)05-0006-02

1仪器与材料材料

1.1供试品葡萄糖酸钙锌颗粒（批号：140101、140102、140103，1g/袋，每袋含葡萄糖酸钙600mg，葡萄糖酸锌30mg，盐酸赖氨酸100mg）贵州联盛药业有限公司生产。

1.2仪器LMQ.C型高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械有限公司）；SW-CJ-2FD洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司）；HHS型电热恒温水浴箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；HP250电热恒温培养箱（南京恒裕电子仪器厂）；MJ-250-1霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3培养基pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸均由北京陆桥技术有限责任公司生产。

1.4菌种大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B)44102］ 第3代；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B) 26003］第3代；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［CMCC(B) 63501］第3代；白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC(F) 98001］第3代，黑曲霉( Aspergillus niger)［CMCC(F) 98003］第3代［1］。

2方法与结果

2.1菌液制备方法接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24h，分别取上述培养物1ml，加0.9%的无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液; 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48h，取培养物1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu 的菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23～28℃培养5～7d，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80用0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取原液1ml，加含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释制成每1ml含孢子数为50～100cfu 的孢子悬液［1-2］。

2.2供试液制备按规定称取供试品葡萄糖酸钙锌颗粒10g于含玻璃珠的灭菌三角烧瓶内，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液中，放置40℃水浴锅温浴20min，用振荡器振荡至少30min，待充分溶解后混匀作为1∶10供试液［1］备用。

2.3菌落计数方法的验证

2.3.1试验组取1∶10供试液1ml含50~100cfu的试验菌液（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉），分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌同时制备2个平皿，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置30～35℃培养3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培养5d，测定其菌数。

2.3.2菌液组分别吸取含50~100cfu的试验菌液（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉），注入灭菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和玫瑰红钠琼脂培养基（白色念珠菌和黑曲霉），每株试验菌平行制备2个平皿，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置30～35℃培养3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培养5d，测定其菌数。

2.3.3供试品对照组取1∶10供试液1ml注入灭菌平皿，同时制备4个平皿，其中两个立即倾注营养琼脂培养基，置30～35℃培养3d，计数细菌本底菌数，另外两个立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23～28℃培养5d，测定霉菌及酵母菌本底菌数。

2.3.4培养与计数试验重复3 次，计算各试验菌株的回收率［回收率=（实验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100%］，结果见表1。

由表1可知，常规平皿法3次试验5株菌株回收率分别都是在70% 以上，说明该方法可用于葡萄糖酸钙锌颗粒细菌、霉菌及酵母菌的计数检测。

2.4控制菌检查方法的验证　

2.4.1实验组取供试液10ml和含50～100cfu大肠埃希菌的试验菌液分别加入100ml胆盐乳糖增菌培养基中，放置30～35℃恒温培养箱中培养18～24h，用无菌吸管吸取0.2ml加入盛装5ml 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基管内，放置30～35℃恒温培养箱中培养，分别在5h和24h在366nm紫外灯下观察结果，然后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液观察结果，结果见表2。

2.4.2阳性对照组取含50～100cfu大肠埃希菌的实验菌液加入100ml胆盐乳糖增菌培养基，按照实验组的操作方法同法操作。

2.4.3阴性对照组用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液替代供试液，不加试验菌液，按照实验组的操作方法同法操作。

由表2可知，葡萄糖酸钙锌颗粒可用直接接种法进行控制菌检查。

3结论

从验证结果来看，菌落计数方法的验证采用常规平皿法时大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别都是在70%以上，控制菌检查方法的验证采用直接接种法时，实验组检出了试验菌，说明本品对这几株菌是没有抑菌作用的。

在生产厂家不改变原辅料、生产工艺、检验及处方等条件下，葡萄糖酸钙锌颗粒的细菌计数方法可采用常规平皿法进行计数检测，霉菌及酵母菌计数方法可采用常规平皿法进行计数检测，控制菌大肠埃希菌可采用常规直接接种法进行检测。

此微生物限度检查方法用于葡萄糖酸钙锌颗粒微的微生物限度检查时，是有效可行的，能保证药品检测的可靠性和准确性。

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参考文献

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010:107-116.

［2］中国药品生物制品检定所．中国药品检验标准操作规范［M］.北京：中国医药科技出版社，2010:351-407.

(收稿日期：2014.12.06)