HPLC校正因子法在药物分析中的应用

摘要：随着对药物有关物质的深入研究和国内仿制药一致性评价的开展，杂质相对于主成分的校正因子测定越来越受到重视。本文在分析国内外近年来校正因子相关文献的基础上，介绍了校正因子的定义、目前的测定方法和应用情况；阐述了目前杂质校正因子在测定和应用中的一些规律和要点，并对其在测定和应用中存在的问题进行了讨论，为今后校正因子测定的标准化和规范化研究提供参考依据。

　　关键词：HPLC；校正因子；响应因子；主成分自身对照法；对照品替代法

　　标准物质一直是药品质量控制特别是纯度和含量分析的首选，但标准物质的供需矛盾，如有些杂质标准物质不易获取以及多个标准物质同时使用所带来的高昂检测成本等因素限制了标准物质的实际应用。为解决这一问题，替代方法应运而生，高效液相色谱（HPLC）校正因子法便是其中之一。该方法最初主要用于HPLC有关物质检查时对于特定杂质的定量[1]，进而又逐渐用于中药多指标含量的测定[2]，发展至今已经成为一项成熟的分析方法。近年来，随着国内仿制药一致性评价的深入开展，有关物质作为药品的关键质量属性已成为被评价的重要内容之一[3]，而在有关物质申报资料中缺少校正因子的研究是药品审评中心通知申请企业补充完善资料的一个主要原因[4]，这使得校正因子的研究重回企业和科研单位的视线，成为被关注的焦点。目前，国内外有关校正因子在测定和应用方面鲜有详细的指导原则发表，因此本文综述了近年来国内外相关领域的研究进展，以期总结出校正因子在测定和应用方面的一些规律和存在的问题，给企业提供更多的参考依据。

　　1定义

　　在HPLC法定量测定中通常所讲的校正因子是某物质i与所选定的参照物质s的绝对校正因子之比，即相对校正因子[5]，其计算公式如下（公式1），校正因子在各国药典中均有应用，只是表述方式不尽相同。《中国药典》与《欧洲药典》（EP10.0）基本一致，使用校正因子（correction factor）的概念，差别在于国内要求当已知杂质对主成分的相对校正因子在0.9~1.1内时，可以用主成分自身对照法计算杂质的含量，超出这个范围时宜用杂质对照品或者加校正因子的主成分自身对照法计算杂质的含量[6]；而EP10.0中则规定校正因子在0.8~1.2时仍可使用主成分对照法计算杂质含量。《美国药典》（USP）中给出了相对响应因子（relative response factor）的概念，从其各论中具体计算方法可以推导出相对响应因子与相对校正因子是互为倒数的关系，在使用时需要注意将待测峰面积（A）与校正因子相乘或与相对响应因子（f）相除以校正峰面积。

　　其中c为待测物和参比物溶液浓度。另外校正因子的使用也有一定的范围[5]，如校正因子在0.2~5.0的范围以外时，表明杂质与主成分的UV吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件，使校正因子位于上述范围内，或使用结构或UV吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物质（如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质），重新确立校正因子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当的杂质方式定量。

　　2测定方法

　　2.1HPLC-UV/PDA方法

　　2.1.1单点法制备适当浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，按照公式1计算得到校正因子。该方法的优点是操作简单，

　　但由于无法排除样品处理或者检测过程所引入的偶然误差，且没有考虑到样品浓度对测定结果的影响等因素，因此该方法主要用于预实验时粗略的估计实验结果，在校正因子定值时实际应用较少[7]，文献中仅检索到Yuan等[8]应用一个浓度点平行测定两组结果以均值作为校正因子，用于羟苯乙酯替代大蒜辣素标准物质对样品中大蒜辣素的含量进行测定。

　　2.1.2多点法制备适当的高、中、低三水平浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液，如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度[5]，分别注入液相色谱仪进样测定，按照公式1计算得到多个校正因子值，求取平均值作为校正因子。目前该测定方法在中药多指标对照品替代测定中应用较为广泛[7,9,10]，但在杂质含量确定方面应用较少。

　　2.1.3标准曲线法目前，校正因子的测定最常用的方法还是标准曲线测定法。具体操作如下：精密称取待测物对照品和参比物对照品各适量，分别配制成不同浓度的系列溶液，如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用，则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度[5]，分别注入液相色谱仪进样测定，以浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，分别绘制参比物和待测物标准曲线A=kc+b，当b=0时，可以推导出两者的相对校正因子为二者斜率k之比[11]，即公式2：

　　f=k参比物/k待测物(2)

　　其中k分别为参比物和待测物标准曲线的斜率。

　　2.1.4联立方程法前述3种HPLC方法使用的前提就是待测物和参比物最好备有色谱纯的化学试剂或标准物质，即使没有色谱纯，也要确知物质的百分含量。但在药物研发的早期，很难得到已知杂质的纯品，因此，Yu[12,13]提出了一种无纯样色谱校正因子的测定方法。根据校正因子与峰面积成正比（校正因子是常数的条件）的前提，设一“标”样仅含A、B二组分且都出峰，各组分的量之和为一定值（如A、B两组分含量之和为100%），因而可建立各组分的量之和与校正因子、峰面积三者之关联式，另一“标”样亦仅含A、B二组分，但峰面积有差异（即二组分含量有异），同样可建立三者关联式，解两个关联式即可得各组分校正因子。由此推论有几个组分就要建立相应个数的关联式求解而得到各组分的校正因子。该方法为早期检测研发中带有多个未知校正因子组分的样品提供了一个新的解决思路，但是受早期研发样品中可能还含有很多未知杂质等因素的限制，目前可以检索到该方法的实际应用较少[14,15]。

　　2.2紫外吸光系数比值法

　　结合文献[16]，Xu等[17]首次推导出了公式3，证明了两物质的相对校正因子是两者的百分吸光系数（E）之比。

　　f=E待测物/E参比物（3）

　　因此可按吸光系数测定的相关技术要求，如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸光度介于0.3～0.8之间、至少5台不同型号的UV分光光度计、2份供试液同时平行制备测定、同台仪器2份供试液的平行测定结果不超过±0.5%等[5]，以流动相为溶剂，测定待测物和参比物在检测波长处的紫外吸收系数E1%，计算比值，求得校正因子。

　　2.3HPLC联用其他方法

　　2.3.1HPLC-UV/PDA串联其他检测器方法为解决HPLC-UV/PDA检测器方法有时很难获得待测物和参比物标准物质的难题，有研究者提出通用型质量检测器技术

　　与PDA或UV检测器串联以确定校正因子的方法。这种通用型质量检测器产生的峰面积与相应的进入检测器的分析物的量成正比关系，而与分析物的结构特性无关，从而可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系，再结合UV/PDA检测器得到的峰面积，由公式1可推导出待测物相对于参比物的校正因子，如公式4所示：

　　在药物早期研发过程中使用此方法可以快速方便的测定特定杂质的相对响应因子，不需要进行杂质的分离纯化，也不需要杂质标准品，甚至可以不需要知道分析物的浓度[18]。目前可与紫外检测器串联测定相对校正因子的通用型质量检测器主