真菌生物膜耐药机制与防治研究进展

郭彦伟1,3 王凌峰2 孟昭彦3 焦二莉3

1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010021； 2.内蒙古医科大学第三附属医院烧伤科，内蒙古包头 014010；

3.内蒙古医科大学第三附属医院检验科，内蒙古包头 014010

[摘要] 真菌已成为医院获得性感染的重要病原体,在抗真菌治疗过程中耐药性真菌的增加引起医学界广泛关注，真菌生物膜的发现和其在真菌耐药性中发挥的作用引起学者广泛的重视，真菌生物膜耐药与防治研究不断进入新领域。该文旨在阐明真菌生物膜的重要性，从生物膜的胞外机制、外排泵基因表达以及药物靶点的基因变异几个方面来阐述真菌生物膜的耐药机制，总结真菌生物膜病防治的最新研究进展。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 真菌；生物膜；耐药机制

[中图分类号] R379 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）09（c）－０197-02

由于临床广谱抗菌药物治疗、器官移植、免疫抑制剂治疗、内置医疗器材治疗、放化疗以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行使得真菌感染的发病率呈上升趋势，由于效率低下的诊断方法和不恰当的初始抗真菌治疗使真菌感染死亡率高达45%[1]。真菌感染分离的真菌性病原微中白假丝酵母菌感染所占比例55%以上，甚至有报道高达66.7%[2-3]，真菌耐药性发生是临床抗真菌治疗效果不佳的重要原因，已证实病原真菌生物膜的形成是真菌产生耐药性重要因素之一[4]，临床上大约有65%的感染与微生物在组织、器官或医疗设备表面形成生物膜有关。该文从常见致病菌生物膜的形成的结构及影响因素、生物膜可能的耐药机制以及真菌生物膜病的防治方法等几个方面进行综述，阐明当前临床对真菌生物膜耐药机制与防治研究进展。

1 生物膜的结构及影响因素

1.1 生物膜的结构

生物膜是真菌形成菌落的生存方式，Chandra等通过激光扫描共聚焦显微镜对白色念珠菌生物膜超微结构观察发现生物膜（biofilm）是微生物群落为了自我保护而产生的一种可黏附组织表面由其自身产生的细胞外聚合物基质（ECM）包裹的三维结构菌细胞群体，对生物膜形成过程分进行详细观察后将其形成过程分为早、中、晚3 个阶段[5-6]。

1.2 生物膜形成的影响因素

生物膜的形成受包括宿主的免疫状态、营养成分、药物以及生长环境的物理、化学因素等多种因素影响。孙秋宁等研究发现血清及组织液有增加念珠菌粘附于生物材料表面的作用，能够明显增加生物膜念珠菌活性，可以促进生物膜形成[7]。

早在2002年就有研究报道白色念珠菌可以分泌一种容量感应分子法尼醇可以抑制白色念珠菌生成菌丝从而控制细胞增殖避免过量细胞造成的营养竞争, 同时促使菌体游离形成新生物膜，在生物膜形成中起重要作用[8]。

2 生物膜的耐药机制

2.1 生物膜的屏障作用

细胞外聚合物基质（ECM）是组成生物被膜结构的基质物主要由碳水化合物、蛋白质等成分组成。 碳水化合物中的主要组成部分β-1，3葡聚糖由位于细胞膜中β-1，3葡聚糖合成酶催化合成，β-1，3葡聚糖能螯合唑类抗真菌药物的被称为“药物海绵”，能够吸附大量抗真菌药物从而延迟药物渗入起到物理屏障作用，是白念珠菌生物膜耐药的重要原因[9]。

2.2 生物膜外排泵基因及相关表达

真菌基因组研究证实真菌基因组中转运蛋白编码基因所表达的蛋白产物中ATP 结合盒（ABC）转运蛋白超家族和主要易化子超家族（MFS）是真菌主要转运蛋白超家族。ABC 转运蛋白超家族是一种ATP 结合型转运蛋白包括五个蛋白家族，是主要外排蛋白，被命名为多药耐药家族（MDR）、多药耐药相关蛋白家族（MRP）和多效性耐药家族（PDRI）的3个蛋白家族与胞内毒性物质的外排密切相关[10]。MFS 转运蛋白其中两个家族，与外排毒性物质功能相关。ABC和MFS的高表达可引起多种抗真菌药特别是三唑类抗真菌药物交叉耐药[11]。Mukherjee 等通过建立基因缺失的菌株模型和检测药物外排泵的功能实验证实外排泵仅在生物膜形成早期在相关耐药性中起着重要作用[12]。

2.3 药物靶点基因变异

抗真菌药物作用机理大致可分为3种：①与真菌细胞膜成分结合破坏细胞膜完整性，如多烯类；②抑制关键酶活性，阻止细胞壁或细胞膜成分合成，如烯丙胺类、氮唑类和棘白菌素类；③干扰有丝分裂和DNA合成，如嘧啶类、抗生素类。临床常见感染性真菌对多烯类药物如两性霉素B耐药非常罕见，耐药性研究较少，学术界普遍认为真菌对多烯类药物内要可能存在3种假说[13-14]:①两性霉素B穿过真菌细胞壁通路发生改变；②细胞膜中脂类发生改变，两性霉素B与细胞膜结合机率降低了；③真菌细胞对两性霉素B药物作用敏感性降低。有文献报道通过体外诱导使ERG3基因突变使细胞膜中麦角固醇合成障碍导致两性霉素B耐药[15]。平滑假丝酵母CgERG6基因的突变促进假菌丝的生长是平滑假丝酵母耐药株对多烯类药物敏感性降低的原因。临床分离的烯丙胺类耐药菌株较少，对耐药株的角鲨烯环氧化酶编码基因（SE）进行测序分析发现1个氨基酸L393F突变，可能是其产生耐药性的原因。氮唑类抗真菌药物耐药的原因是编码其作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶的ERG11基因变异或过度表达。棘白菌素类是由于编码β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的FKS1和/或FKS2基因点突变，导致真菌对脂肽类抗菌药物的敏感性明显降低。

真菌对氟胞嘧啶原发性耐药很低（＜2%），继发性耐药依赖与嘧啶药物作用不同靶酶的失活：①真菌通过编码胞嘧啶通透酶的基因fcy2点突变，影响药物的吸收降低细胞内药物积累。②编码胞嘧啶脱氨酶基因fcy1或编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因fur1的点突变也可以导致获得性氟胞嘧啶耐药。这些酶催化5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，使药物反起作用。最常见的获得性耐药氟胞嘧啶是基于fur1基因点突变。

3 真菌生物膜病的防治

3.1 传统药物防治

采取联合使用药物的治疗策略，例如两性霉素B与氟胞嘧啶，氟胞嘧啶与氟康唑，两性霉素B与氟胞嘧啶，卡泊芬净与脂质体两性霉素B，卡泊芬净与氟康唑等的联合用药，使药物协同抗菌作用发挥疗效。

开发抗真菌药物的新剂型，如两性霉素B脂质体，两性霉素B脂质复合物，两性霉素B胶体分散体，伊曲康唑，和β-环糊精伊曲康唑等新剂型，药物新机型对真菌生物膜作用明显但作用机理尚不清楚。

3.2 新药物开发

3.2.1 天然植物提取 植物中含有大量的生物活性分子，精油的主要成分是植物提取物，其对不同微生物的具有较强的抗菌活性，在这方面萜烯、香芹酚、香叶醇、和麝香草酚在白色念珠菌感染医疗设备的防治中的作用已被证实。另外，萜类化合物具有优良的抗白念珠菌酵母和菌丝形式生长活性且对HeLa细胞无毒。因此，在不久的将来萜类化合物可能不仅作为一种抗真菌药物单独使用还可以协同常规药物如氟康唑用于抗真菌治疗。钟罗枫等人通过体外培养白色念珠菌生物膜，在生物膜生成不同阶段给予紫檀芪证实其对白色念珠菌生物膜具有显著抑制作用。

3.2.2 人工合成 菌药物的第2个来源包括非聚合合成剂，可分为四组。第1组是一类以N，N-二甲双胍复合物为基础的化学制品，由于这些化合物显示出较低的细胞毒性，因此可作为潜在的广谱抗生素。第2组是一类传统抗真菌药物结构的衍生化合物，其中一些比原来的结构有着更好的抗菌作用。第3组是由合成的肽类物质组成的，即“人乳铁蛋白衍生肽”，其在临床前期试验和临床试验有着很好的耐受性。最后一组是半合成天然产物的衍生物，如棘白菌素衍生物，米卡芬净钠，阿尼芬净，乙酸卡泊芬净和纽莫康定。这些改进的药物在某些性能上优于初始的天然产物。可惜的是，棘白菌素衍生物的口服给药时吸收差，因此仅用于静脉注射。在白色念珠菌的治疗上，一种可以与醋酸卡泊芬净媲美的天然的抗真菌成分已经分离出来。这种成分被命名为绿原酸拟肽，是一种新的抑制（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的三萜糖苷。从绿原酸拟肽衍生的几种合成产品，目前正在开发中，以优化在体内的抗真菌活性和口服疗效。

3.3 中草药应用

在抗真菌治疗中传统中药不良反应小、标本兼治的优势逐步显现出来，具有独特的抗菌机制和提高机体免疫力的作用。汪长中等人通过制作念珠菌的生物膜, 不同生长时期给予中药，发现穿心莲内醋、黄芩苷对的生物膜具有较强的抑制作用。 许颖等人研究发现五倍子煎液对初期阶段的白念珠菌生物膜具有抑制作用。目前已发现近300种中草药如姜黄油、山苍子油、大蒜、太子参、白术、黄茂、土模皮、大黄等具有较强的抗真菌的作用，并能有效抑制菌的生物膜形成。

4 结语

虽然随着真菌生物膜形成机理和耐药机制的研究不断深入，研究学者不断发现新的抗真菌药物和治疗方法，但是由于体内外的差异性和耐药性菌株的不断出现，临床在真菌感染的防治任然面临巨大的挑战，需要不断的研究和探讨。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献

[1] Wisplinghoff H，Bischoff T，Tallent，et al．Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study[J]．Clinical Infectious Diseases，2004，39：309–317．

[2] 冯文莉，杨静，奚志琴，等.3年间医院内侵袭性真菌感染的病原菌分布及临床分析[J]．中华医院感染学杂志，2008，18（7）：1030-1033.

[3] 李文波，刘丽华，张玉娟，等. 2010～2012年医院感染真菌的临床分布及耐药性分析[J]．国际检验医学杂志，2013，34（18）：2409-2410,2412.

[4] Ramage G，Mowat E，Jones B，et al. Our current understanding of fungal biofilms[J]．Crit Rev Microbiol，2009，35(4)：340－355．

[5] Chandra J，Kuhn DM，Mukherjee PK，et al．Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans：development，architecture，and drug resis tance[J]．J Bacteriol，2001，183（18）：5385－5394．

[6] 李丽娟，陈伟，许辉，等．曲霉生物膜的形成过程与结构特征[J]．中国真菌学杂志，2011，6（2）：93-97.

[7] 孙秋宁，方凯.念珠菌生物膜的结构、影响因素及其对抗真菌药的敏感性[J]．中国医学科学院学报，2002，24(4)：385-388.

[8] 王聪，白丽．真菌生物膜研究进展[J]．中国病原生物学杂志，2012，5（3）：218-220.

[9] Nett JE，Sanchez H，Cain MT，et al．Genetic basis of Candida biofilmresistance due to drug-sequestering matrix glucan[J]．J Infect Dis 2010，202（1）：171－175．

[10] Gbelska Y，Krijger JJ，Breunig KD．Evolution of gene families：the multidrug resistance transporter genes in five related yeast species[J]．FEMS Yeast Res，2006，6（3）：345－355．

[11] 廖勇，敖俊红，杨蓉娅．病原真菌外排转运蛋白与真菌耐药的研究进展[J]．实用皮肤病学杂志，2011，4（4）：215-218.

[12] Mukherjee PK，Chandra J，Kuhn DM，et al．Mechanism of fluconazole resistance in Candida albicans biofilms：phases pecific role of efflux pumps and membrane sterols[J]．Infect Immun，2003，71（8）：4333－4340．

[13] Andre B.Antibacterials and antifungals[M]．Antimicrobiol agents，Washington DC：ASM Press，2005：1265．

[14] 崔宇慧，唐建国．真菌对临床抗真菌药物的耐药机制[J]．中国抗生素杂志，2011，36（10）：733-737.

[15] Mishra NN，Prasad T，Sharma N，et al．Pathogenicity and drug resistance in Candida albicans and other yeast species．A review[J]．Acta Microbiol Immunol Hung， 2007，54（3）： 201－235．

（收稿日期：2014-06-22）