实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应 (RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

姜红涛 姚秀林

抚顺市疾病预防控制中心，辽宁抚顺113006

[摘要] 目的 比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法 采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法，同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。 结果 细胞培养病毒分离的阳性数为26份，实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份，χ2=8.1， P<0.005。 结论 通过该实验，验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感，适用于实验室快速诊断。

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关键词 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应；细胞培养法；流感病毒

[中图分类号] R4[文献标识码] A[文章编号] 1674-074２（２０１5）03（b）－０192-02

[作者简介] 姜红涛（1965-），女，天津人，本科，主管检验师，主要从事病毒检验工作。

2013年出现的流感病毒H7N9经自然重配，致病迅速，易变异，给人们带来极度恐慌，引起WHO 的高度重视[1]，从而使流感病毒病原学的准确快速诊断显得尤为重要。该实验室在2014年1月采用整群抽样法对抚顺市流感监测哨点医院的80份疑似流感样标本进行了实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法进行了检测流行性感冒病毒的方法比较，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

2014年1月在抚顺市国家级流感监测哨点医院，每周采集内科和儿科门诊就诊的流感样病例（体温≥38℃，同时伴有咳嗽或者咽喉疼痛等症状的急性呼吸道感染者）的咽拭子标本，放人pH 7．4-7．6的DMEM采样液中，当日低温送流感实验室检测，每周采集 20份流感样病例的咽拭子标本。

1.2主要试剂

①抗A（H1N1）亚型血清，抗A（H3N2）亚型血清，抗A（H3N2）亚型血清，抗A（SWL1）亚型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由国家流感中心提供。MDCK细胞，辽宁省疾控中心提供；胰酶、Hank’液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白组分V， 采购于BI公司。DMEM培养基，采购于GIBCO公司。

②提取RNA试剂盒为QIAGEN。

1.3主要仪器

AB PCR仪；二氧化碳培养箱 ；倒置显微镜等。

1.4实验方法

1.4.1采用细胞培养法分离流感病毒，细胞为狗肾传代细胞（MDCK）每份标本接种细胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hank’s液洗2遍，加入病毒维持液，置34.5 ℃培养，每天观察病理变化（CPU），当CPU出现3～4个加号时，按常规法检查维持液中的红细胞凝集活性。将HA≥1：16的标本采用血凝抑制方法（HI）进行流感病毒型别鉴定[2]。确定病毒的型别和亚型。并送国家流感中心做进一步鉴定。HA≤1：16的标本未做分型鉴定。

1.4.2RT-PCR反应体系的配置[3-4]反应条件：60℃ 5min→ 50℃ 30min→ 95℃ 15min→95℃ 15s，55℃退火30 s（收集荧光），72℃延伸 30s 45 cycle→ 72℃ 5min→4℃ 保存。见表1。

1.5统计方法

配对设计的χ2检验，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差异有统计学意义。

2结果

2.1两种方法对80份咽拭液检测流行性感冒病毒的结果

细胞培养分离病毒26株，阳性百分率32.50%，RT-PCR检出36株，阳性百分率45.00%，见表2。

2.2两种检验方法统计结果比较

细胞培养分离病毒36株，阳性26株，RT-PCR检出36株，两种检验方法统计结果为χ2=8.1，因为χ20.005，1=7.88，所以P<0.005，两种检验方法敏感性差异有统计学意义。见表3。

2.3两种方法对80份咽拭液检测流行性感冒病毒的分型结果

细胞培养分离病毒H1N1（22份），H3N2（4份），荧光定量RT-PCR分离病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3讨论

流感病毒病原学相关检测目前常用的有病毒分离培养法、快速检测、分子生物学方法等。病毒分离是诊断流感病毒的金标准[5]，但耗时长是其缺点。而且宿主细胞生长状态也是影响病毒生长及复制的关键因素[6]，导致疑似流感样标本到实验室后，培养完成时间不确定。同时培养液中营养物质的持续消耗以及宿主细胞的逐渐死亡是导致病毒滴度降低的直接原因[7]，收获的病毒滴度高低存在着很多的不确定因素。而且，标本采集后的保存运送等环节都对MDCK培养分离流感病毒存在较大的影响。而实时荧光定量RT-PCR法应用于流感病毒实验室诊断，国内外早已有许多报导[8]，它具有灵敏度高、特异性好、检测所需时间短等等优点，尤其在应急疫情快速诊断中得到了广泛的应用。它与经典的MDCK细胞分离法相比，检测时间可缩短到1 d之内。由于在封闭管中进行，省略了电泳这一步骤，减少了以往PCR技术导致的假阳性可能[8]。

该实验室对2014年1月流感监测点送检的80份标本，采用细胞培养、实时荧光定量RT-PCR 两种方法检测，同时进行比较， 结果证实，实时荧光定量RT-PCR法对流行性感冒病毒的检出率为45.00%，高于细胞培养法的病毒检出率32.50%。实时荧光定量RT-PCR法和细胞培养法两种检验方法χ2检验结果为χ2=8.1，P<0.005。对流感病毒的检出敏感性差异显著，对流感病毒的分型也是准确无误，在病毒含量较低的标本中不存在漏检情况发生。通过这两种方法的比较，与浙江省疾病预防控制中心通过比较得出的，实时荧光定量RT-PCR法对大量疑似标本进行实验室快速鉴别诊断，实用性强，快速敏感[9]的结论一致。验证了实时荧光定量RT-PCR法确实是实验室快速诊断流行性感冒病毒的首选方法，用实时荧光定量RT-PCR法检测为流感病毒阳性的标本接种MDCK细胞，培养分离流感病毒，可以降低细胞培养法分离流感病毒的成本，减少不必要的试剂材料的消耗，提高检测效率。这仅仅是本实验室的验证结论，还需要其它研究中心加以验证。

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参考文献

[1]WHO. Human infection with influenza A（H7N9）virus in Chi－na[J].N Engl J Med， 2013（368）：1888-1897.

[2]中国疾病预防控制中心．全国流感/人禽流感监测实施方案（2005—2010年度）[Z].2005-09.

[3]《流行性感冒诊断标准》WS285-2008[S].

[4]WHO． Sequencing primers and protocol[EB /OL]http： / /www ． who． int/entity/csr/resources/publications/swineflu/GenomePrimers_20090512．pdf，2011 /2011 ，11，08．

[5]刘建军，程小雯，贺建华．用鸡胚和MDCK细胞分离流感病毒的实验研究[J].中国公共卫生，2002（8）：335-336.

[6]冯婷，殷仲伟，李晋蓉. 流感病毒H1N1在MDCK细胞的培养及纯化条件的优化[J].中国病原生物学杂志，2012，7（7）：493-496.

[7]Youil R，Su Q，Toner TJ， et al，Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines [J].J Virol Methods，2004（120）：23-31.

[8]Von Elden，Kenton Lohman，Luke TDaum.Simutanous Detection ofInfluenza viruses A and B using Real-Time Quantitative PCR[J].Journal of clinical Microbiology，2003，39（1）：3597-3601.

[9]李婵，卢亦愚，等.实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较[J].中国计划免疫，2005，11（5）：360-363.

（收稿日期：2014-12-16）