广西白裤瑶线粒体DNA HVRⅠ区多态性分析

吴群英　莫小梅　黄岚珍　王凌宇　黄　江　肖福英

（桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 541004）

【摘　要】目的: 通过对白裤瑶族线粒体DNA D-Loop HVRⅠ区序列碱基的测定，了解其遗传多态性。方法: 应用PCR 扩增产物及直接测序法, 对31名白裤瑶无血缘关系健康个体mtDNA HVRⅠ区进序列检测及分析。结果: 与Anderson 相应序列比对，白裤瑶群体mtDNA HVRⅠ区发现了88处突变，界定了3种单倍型，基因差异度分别为1.00, 偶合概率为0.25。结论: 广西白裤瑶线粒体DNA HVRⅠ区多态性有一定的本民族特点。

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关键词 白裤瑶；线粒体DNA；多态性

※基金项目：2011年新世纪广西高等教育教改工程项目（2011JGB084）;桂林医学院2009年度青年教师科研启动基金项目（院科字(2008)18号）；2013年度桂林医学院教学研究与改革委托课题（院教发字[2013]23号。

作者简介：吴群英（1976—），女，汉族，硕士，讲师。

通讯作者：肖福英。

白裤瑶是瑶族中民族特色保留较为完整的支系之一，自称“努格劳”，因其男子穿及膝的白裤而得名“白裤瑶”,主要集居在广西南丹县和贵州荔波县相接壤的里湖瑶族乡、八圩瑶族乡和瑶山瑶族乡等地[1]。人类线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是一个由16569个碱基组成的闭合环状双链分子，由于母系遗传的特性，缺乏重组、进化速率高、群体内变异大等特点，而被广泛地应用于人类群体的起源、演化和亲缘关系以及疾病的遗传的研究。本文采用聚合酶链反应(PCR）技术及DNA测序法对广西南丹白裤瑶族mtDNA D-Loop HVRⅠ区进行了研究, 为少数民族群体遗传学研究提供新的数据。

1　材料与方法

1.1　样本来源

31名体检健康的白裤瑶样本均采自广西河池市南丹县，彼此间无亲缘关系，3代均为白裤瑶族，所有研究对象均知情同意。

1.2　mtDNA的提取

用消毒棉签刮取口腔黏膜细胞，浸泡于生理盐水中，将采集口腔黏膜细胞的棉签用生理盐水把口腔细胞清洗出来于1.5mlEP管中，进行13000 rpm，离心15min，小心弃去上清，然后加入200ul 10％chelex100树脂，56℃水浴30min，取出后振荡5-10s,100℃水浴10min，离心3min，4℃保存，上清用于PCR扩增。

1.3　HVRⅠ区的PCR扩增

PCR反应总体积为50ul，引物各1 umol/L, 上游引物：5’-TTAACTCCACCA-TTACCACC-3’，下游引物：5’- GAGGATGGTGGTCAAGGGAC -3’（由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增片段长度为440bp），2×Taq PCR Master Mix 25ul, DNA模板5ul，去离子水补足50 ul。反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃延伸10min。

1.4　PCR产物的检测及测序

每个样品均取 10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察扩增结果； 40ulPCR产物委托上海立菲生物技术有限公司进行测序。

1.5　统计学分析

测序结果与剑桥标准Anderson 序列比较，统计变异位点及变异类型。按照公式P=∑x2( x 为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,按公式h =(1-∑x2) n / ( n - 1)( n为样本含量)计算基因变异度。

2　结果

2.1　HVRⅠ区的PCR扩增

用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小及纯度，结果表明，31例白裤瑶样本均成功扩增，扩增片段大小为440bp（见图1）。

2.2　HVR Ⅰ区的多态性

将31例白裤瑶族HVRⅠ区的PCR扩增产物测序后，所得的核苷酸序列分别与Anderson标准序列进行比较，共检测出88个突变位点，其中以碱基置换为主，包括30个碱基转换，57个碱基颠换，1个碱基缺失，1个碱基插入。碱基颠换明显高于碱基转换、插入及缺失，碱基颠换占总碱基变异的64.77％，其中A-C的颠换占总碱基变异的39.44％（见图2）。

2.3　HVR ⅠⅠ区基因变异度和偶合概率结果

按照公式P=∑x2( x 为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,公式h =(1-∑x2) n / ( n - 1)( n为样本含量)计算基因变异度[2]。计算得出偶合概率为0.25，基因变异度分别为1.00。由此说明，广西白裤瑶族线粒体DNA HVRⅠ区具有较高的序列多态性。

2.4　mtDNA HVRⅠ区14bp 高变结构域

Anderson 序列在16180-16193 位置有一个14bp 富含C 的高变结构域, 连续9 个C 被16189 位点的T 隔开, 其长度及序列因受碱基插入、缺失、转换、颠换等影响而出现个体间序列多态性, 该区域也具有典型的人类学特征。本研究出现3种单倍型, 分别为：AAAACCCCCTCCCC(2个),AAAACCCCCTCCTC（1个) , AACCCCCCCCCCCC (1个)。

3　讨论

线粒体DNA D-loop 环区在人类学研究上是非常有价值的DNA区段, 比较研究相应区段的序列间差异和变异速率, 可以获得丰富的进化信息, 为人类起源、进化和人群的迁移提供可靠的遗传信息。本研究选择广西白裤瑶族群体进行线粒体HVRⅠ区序列分析, 研究结果表明在线粒体DNA HVRⅠ区有多个碱基突变, 这表明广西白裤瑶线粒体DNA HVR Ⅰ区具有高度序列多态性, 可以作为法医学个体识别的遗传标记。从广西白裤瑶族线粒体DNA HVRⅠ区碱基突变类型来看，突变以碱基颠换为主，然而HVR Ⅲ区碱基突变却是以碱基转换为主, 以嘧啶(T-C)之间的转换最多,这个结果支持mtDNA 的突变是由于DNA 在复制时错配所造成[3]。

本研究中发现白裤瑶族的有些位点与其他东亚人群间确实存在差异, 白裤瑶族人在nt16093 及nt16183 位置分别出现T-C 和A-C 碱基替换, 而中国汉族人[5]、日本人[6]、朝鲜人[7]却未发现上述部位的碱基突变, 表明白裤瑶族在进化过程中保留了其独特的遗传特征。此外, 由于nt16189 位出现T-C 碱基转换导致nt16180-16193 区域形成的的poly-C( C 重复) 序列,日本人[6]、朝鲜人[7]分别有16、19 种单倍型, 白裤瑶族只有3种。白裤瑶族单倍型少, 是否与样本量有关, 还需要进一步证实。

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参考文献

［１］田培燕,陈应康,罗惠,等.白裤瑶人群12 对遗传性状的基因频率[J].现代预防医学,2009,36(8).

［２］Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J]. Genetics, 1989,123:585-595.

［３］Bendall KE,Sykes BC.Length heteroplasmy in the first hypervariable segment of the human mtDNA control region[J]. Am J Hum Genet,1995,57(2):248-256.

［４］刘雅诚,严江伟,唐晖,等.中国5个民族mtDNA( CA)n 重复的多态性[J].中国法医学杂志,2003,18(1):37-38.

［５］Nishimaki Y, Sato K, Fang L, etal . Sequence polymorphism in the mtDNA HVS-I region in Japanese and Chinese[J]. Legal Med, 1999,1(4):238-249.

［６］Horai S, Hayasaka K. Intraspecific nucleotide sequence differences in the major noncoding region of human mitochondria DNA[J]. Am J H um Gen et,1990,46(4):828-842.

［７］Lee SD, Shin CH, Kim KB, etal . Sequence variation of mitochondrial DNA control region in Korean s[J]. Forensic sci Int,1997,87(2):99-116.

［８］Poulton J,Luan J,Macaulay V,et al.Type 2 diabetes is associated with a common mitochondrial variant:evidence from a population-based case-control study[J].Hum Mol Genet,2002,Jun 15,11(13):1581-1583.

［责任编辑：汤静］