新疆多脂鳞伞对不同氮源物质的多样性利用特征

刘 淼１ａ，１ｂ，林辰壹１ａ，１ｂ，曹 艳１ａ，１ｂ，马 海１ａ，１ｂ，魏 鹏２

（１．新疆农业大学，ａ．林学与园艺学院；ｂ．设施农业研究所，乌鲁木齐 ８３００５２；２．新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 ８３００９１）

摘要：通过新疆阿瓦提野生多脂鳞伞（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ）氮源物质的选择性利用能力评价，掌握新疆野生多脂鳞伞种质资源氮代谢特性，为资源保护和种质创新提供理论依据。通过在１５种不同含氮处理培养基上的菌落形态特征、菌丝体显微观察、生长量、生长速率、生长高峰期、满皿时间、达到总生长量５０％的天数的分析表明，当氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、谷氨酰胺和天门冬氨酸时，多脂鳞伞ＬＬ－０１菌丝体生长速度快、活力强、长势整齐、菌落形态结构完整、锁状联合发育正常。其中当有机氮为蛋白胨、无机氮为硝酸铵、氨基酸类物质为谷氨酰胺时，菌丝体总生长量分别达到７７．７０ ｍｍ、７９．９０ ｍｍ和６５．２７ ｍｍ。阐明了多脂鳞伞对不同性质的氮源采用了不同的氮代谢途径，表现出对不同类型的含氮物质的利用速率和利用效率的差异，且具有氮源利用的多样性特征。

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关键词 ：新疆；多脂鳞伞（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ）；蛋白胨；硝酸铵；谷氨酰胺

中图分类号：Ｓ６４６ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０４－０８２７－０４

ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０４．０１５

收稿日期：２０１４－０７－１０

基金项目：新疆维吾尔自治区十二五重大专项（２０１１３０１０４－２－２）；国家级大学生创新创业训练计划项目（２０１３１０７５８０２０）

作者简介：刘 淼（１９８７－），女，辽宁岫岩人，硕士，主要从事食用菌研究，（电话）１８２９９１４４１５４（电子信箱）ｌｉｕｍｉａｏ１９８７４２６５２２＠１２６．ｃｏｍ；

通信作者，林辰壹，女，教授，主要从事蔬菜种质资源评价与利用、食用菌种质资源评价与利用研究，（电子信箱）ｌｉｎｃｈｅｎｙｉ６５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。

氮源是构成菌体蛋白质、核酸、酶类以及其他含氮化合物的主要成分，是野生菌生长所必需的物质。氮源一般不提供能量，是食用菌重要的营养物质之一［１］，野生食用菌可以利用铵盐、硝酸盐在内的无机氮和各种有机氮，并将其中的氮转变为氮源，维持其快速生长。氮源也是野生食用菌形成人体所需要的维生素、氨基酸等活性物质的重要物质基础［２，３］，尤其与增强机体的免疫能力、抗肿瘤、降血压、抗衰老等物质的合成密切相关［４］。新疆的多脂鳞伞主要分布于新疆天山、阿勒泰山脉的河谷阔叶林中，当地人称之为木黄菇、肥鳞耳、黄丝菌或柳树菌［５］。多脂鳞伞是球盖菇科（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａｃｅａｅ）鳞伞属（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）的一种具有坚果味道的食药用菌［６，７］。无机氮源中的硝酸盐和铵盐，有机氮源中的氨基酸、酰胺和胺等是重要的氮源，研究证明，０．１％～０．３％蛋白胨是多脂鳞伞最佳氮源［８，９］。新疆特殊自然条件下许多生物表现出遗传多样性特征，本研究以新疆阿瓦提县野生食、药用真菌多脂鳞伞［Ｐｈｏｎｌｉｏｔａ ａｄｉｐｏｓａ （Ｆｒ．） Ｑｕéｌ．］为对象，开展了多脂鳞伞对不同性质氮源的选择性利用能力研究。通过探讨新疆阿瓦提县野生的多脂鳞伞对不同性质氮源物质的利用是否存在多样性特点，为多脂鳞伞突变菌株筛选、杂交育种以及生理生化研究奠定理论基础。

１ 材料与方法

１．１ 野生多脂鳞伞的获得与菌丝体活化

野生多脂鳞伞采自新疆阿瓦提县（３９°３１′Ｎ、７９°４５′Ｅ、１ ０２８ ｍ Ａｌｔ）拜什艾日克镇农田防护林柳树的枯洞中。经多代分离获得稳定多脂鳞伞ＬＬ－０１，试验菌株由新疆农业科学院植物保护研究所提供。以ＰＤＡ加富培养基为活化培养基，灭菌后趁热倒平板，取大小为 ５ ｍｍ×５ ｍｍ菌种块接种，２５ ℃黑暗条件下菌丝体活化培养。

１．２ 多脂鳞伞菌株ＬＬ－０１对不同种类氮源的选择性利用研究

无氮培养基的基本配方（ＣＫ）由２０ ｇ葡萄糖、２ ｇ磷酸二氢钾、１ ｇ硫酸镁、０．０５ ｇ维生素Ｂ１、２０ ｇ琼脂组成，定容至１ ０００ ｍＬ［１０，１１］。分别加入２ ｇ的大豆、大豆芽、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、草酸铵、谷氨酰胺、天门冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸，调ｐＨ至７，其他步骤和方法同“１．１”所述，恒温培养７ ｄ。

１．３ 指标测定与数据处理

菌丝长势：＋＋＋表示长势浓密，＋＋表示长势一般，＋表示长势差且稀疏，－－表示萎缩，－表示不生长。

菌落形态特征：○表示边缘整齐完整，□表示老化斑点，◎表示菌丝干缩，¤表示菌丝松散，☆表示菌丝有爬壁，同时观测菌丝生长圈数量以及菌丝是否吐水、菌落形状、中央隆起或倒伏、转色、气味、是否有杂菌抑制线。

显微特征观察：在１０×４０倍Ｍｏｔｉｃ ＳＦＣ－２８显微镜下观测菌丝粗细、分支、形状以及每视野下锁状联合特征等。

每天观测并记录菌丝生长量［１２］，统计并计算平均满皿时间（ＦＴ），即菌丝体生长至培养皿直径大小所需天数（ｄ），平均总生长量ＧＴ（ｍｍ），平均生长速率ＳＧＴ（ｍｍ／ｄ），最大日生长量及出现时间Ｇｍａｘ（ｍｍ／ｎ·d），达到５０％总生长量所需的平均生长天数Ｇ５０ （ｄ）。

每个处理重复５次。每天同一时间观测菌丝长势。试验数据用ＤＰＳ ７．０５进行差异显著性分析，用平均值±标准差表示。

２ 结果与分析

多脂鳞伞菌株ＬＬ－０１菌丝体能够利用所有供试的１５种氮源，接种后第一天菌丝体恢复生长，菌丝体气味正常、污染率低、抗杂菌能力强。通过多脂鳞伞ＬＬ－０１在供试的１５种氮源上的菌丝体长势、生长圈、锁状联合数量、生长速度的比较分析，其对不同氮源种类的利用能力存在显著（P＜０．０５）和极显著（P＜０．０１）差异，表现出氮源的选择性利用的特征。

２．１ 多脂鳞伞ＬＬ－０１对６种有机氮源选择利用特征

多脂鳞伞ＬＬ－０１对供试的６种有机氮源（大豆、大豆芽、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素）的选择性利用差异达到极显著水平（P＜０．０１）。牛肉膏、蛋白胨和酵母膏各处理间的ＳＧＴ无显著性差异，与大豆、大豆芽、尿素处理ＳＧＴ差异极显著（P＜０．０１）。牛肉膏、蛋白胨和酵母膏各处理的长势强，１～７ ｄ内菌丝体生长一直处于增长期，ＦＴ＜７ ｄ，到达Ｇ５０的时间一致（表１）。结果表明，蛋白胨、牛肉膏和酵母膏都是适宜的有机氮源，这与他们还提供大量的无机盐及生长因子有关。

牛肉膏处理的ＧＴ分别是大豆、大豆芽处理的１６７．８２％、１５６．９３％，蛋白胨处理是大豆、大豆芽处理的１８９．９８％、１７７．６４％，酵母膏处理是大豆、大豆芽处理的１７４．５２％和１６３．１９％，Ｇｍａｘ出现日分别比大豆处理提前了１ ｄ、２ ｄ和１ ｄ（图１、表１）。

供试的６种有机氮源中尿素处理下的菌丝体长势稀疏，生长速度缓慢，无爬壁现象，生长圈个数较少（图４、表２），ＦＴ＞７ ｄ，ＧＴ仅为蛋白胨处理的４６．４５％，Ｇｍａｘ出现日比蛋白胨处理提前了３ ｄ，菌丝体利用尿素能力差，与其他氮源处理的差异达到极显著水平（P＜０．０１）（表１）。

通过对菌丝体形态特征和菌丝体生长势的影响分析，供试的６种有机氮源可以分为３组：第一组由牛肉膏、蛋白胨和酵母膏组成，极显著促进菌丝体生长；第二组由大豆、大豆芽组成，显著影响菌丝体生长；第三组只有尿素组成，降低了菌丝体生长势。

２．２ 多脂鳞伞ＬＬ－０１对５种无机氮源选择利用特征

多脂鳞伞ＬＬ－０１对供试的５种无机氮源（硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、草酸铵）的选择性利用差异达到极显著水平（P＜０．０１）。硝酸铵、硫酸铵处理间的ＳＧＴ无显著性差异，与硝酸钾、氯化铵、草酸铵各处理的ＳＧＴ差异极显著（P＜０．０１）。硝酸铵、硫酸铵处理的生长势强，１～７ ｄ菌丝体生长一直处于增长期，ＦＴ＜７ ｄ，到达Ｇ５０的时间一致，硝酸铵、硫酸铵都是适宜的无机氮源（表１）。

硝酸铵、硫酸铵处理的ＧＴ分别是硝酸钾处理的１５５．４８％和１４３．４７％，是氯化铵的１４３．７８％和１３２．６８％。硝酸铵处理的Ｇｍａｘ出现日分别比硝酸钾、氯化铵滞后了５ ｄ和１ ｄ；硫酸铵处理的Ｇｍａｘ出现日比硝酸钾滞后４ ｄ，而与氯化铵处理的Ｇｍａｘ出现日相同（图２、表１）。

草酸铵处理的菌丝长势稀疏、生长速度缓慢、无爬壁现象、无生长圈（图４、表２），ＦＴ＞７ ｄ，ＧＴ仅为硝酸铵和对照处理的１４．９３％和２６．５２％，Ｇｍａｘ出现日比硫酸铵处理提前１ ｄ，菌丝体利用草酸铵能力差，与其他氮源处理的差异达到极显著水平（P＜０．０１）（表１）。

通过对菌丝体形态特征和菌丝体生长势的影响分析，供试的５种无机氮源可以分为３组：第一组由硝酸铵、硫酸铵组成，极显著促进菌丝体生长；第二组由硝酸钾、氯化铵组成，显著影响或不影响菌丝体长势；第三组由草酸铵组成，降低了菌丝体长势。

２．３ 多脂鳞伞ＬＬ－０１对４种氨基酸类物质的选择性利用特征

多脂鳞伞ＬＬ－０１对供试的４种氨基酸类物质（谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸）的选择性利用差异达到极显著水平（P＜０．０１）。谷氨酰胺、天门冬氨酸处理间的ＳＧＴ无显著性差异，谷氨酰胺、天门冬氨酸处理的生长势强，１～７ ｄ菌丝体生长一直处于增长期，ＦＴ＜７ ｄ，到达Ｇ５０的时间一致（表１），谷氨酰胺、天门冬氨酸都是适宜的氨基酸类氮源。

谷氨酰胺、天门冬氨酸处理与甘氨酸、甲硫氨酸处理的ＳＧＴ存在极显著差异（P＜０．０１），谷氨酰胺、天门冬氨酸的ＧＴ分别是甘氨酸处理的１４５．６９％和１３９．０８％，谷氨酰胺处理的Ｇｍａｘ出现日比甘氨酸滞后１ ｄ，而天门冬氨酸处理的Ｇｍａｘ出现日比甘氨酸提前２ ｄ（图３、表１）。

甲硫氨酸处理的菌丝长势稀疏、生长速度缓慢、无爬壁现象、无生长圈、锁状联合较少（图４、表２），ＦＴ＞７ ｄ，ＧＴ仅为谷氨酰胺和对照的３５．４２％和５１．４０％，Ｇｍａｘ出现日比谷氨酰胺处理滞后１ ｄ，菌丝体利用甲硫氨酸能力差，与其他氮源处理的差异达到极显著水平（P＜０．０１）（表１）。

通过对菌丝体形态特征和菌丝体生长势的影响分析，供试的４种氨基酸类物质可以分为３组：第一组由谷氨酰胺、天门冬氨酸组成，极显著促进菌丝体生长；第二组由甘氨酸组成，对菌丝体长势没有影响；第三组由甲硫氨酸组成，降低了菌丝体长势。

综合菌丝体菌落形态特征和菌丝体生长势，牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸铵、硫酸铵、谷氨酰胺、天门冬氨酸都是多脂鳞伞ＬＬ－０１菌株适宜生长的氮源，其中供试的有机氮源中的蛋白胨、无机氮源中的硝酸铵、氨基酸类物质中的谷氨酰胺极显著促进菌丝体生长，表现为菌丝体生长速度快、活力强、长势整齐、菌落与菌丝体形态结构完整、锁状联合发育正常。而尿素、草酸铵、甲硫氨酸为氮源时降低了菌丝体生长势，不适宜作为多脂鳞伞ＬＬ－０１菌株生长的氮源。

３ 小结与讨论

前人研究认为酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵是野生多脂鳞伞驯化过程中菌丝体生长的适宜氮源［１３，１４］，这些研究结果表明多脂鳞伞具有氮源的选择性利用特性。本研究对驯化成功的多脂鳞伞ＬＬ－０１进行了较全面的氮源利用能力评价，再次证实了源自新疆阿瓦提的多脂鳞伞除了能够利用这些氮源以外，还对其他不同性质的有机氮、无机氮、氨基酸存在着多样化的选择性利用特征，其中硝酸铵、硝酸钾、氯化铵、谷氨酰胺和天门冬氨酸是首次报道的多脂鳞伞的适宜氮源。

以蛋白胨为氮源时，多脂鳞伞ＬＬ－０１的菌丝锁状联合较多，菌丝长势茂密。以硝酸铵为氮源时菌丝体总生长量最大，菌丝生长速率最快，４ ｄ可以达到总生长量的５０％，硝酸铵能够为机体提供必需的氮源，促使细胞内蛋白质合成。

不同于阿魏菇（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｆｅｒｕｌａｅ）对氮源的选择性利用［１５］，多脂鳞伞ＬＬ－０１对于大豆和大豆芽的利用较差。也不同于绣球菌（Ｓｐａｒａｓｓｉａ ｃｒｉｓｐａ）菌丝对硝酸钾、氯化铵的利用能力［１６］，多脂鳞伞ＬＬ－０１在硝酸钾、氯化铵的处理中有生长现象，但生长速度缓慢。

１５种氮源处理中，尿素、草酸铵、甲硫氨酸处理极显著降低了多脂鳞伞ＬＬ－０１菌株的生长势并影响了菌丝体的形态建成，进一步阐明多脂鳞伞对不同氮源种类的选择性利用特性，这些物质如何影响氮代谢生理机制还有待进一步深入研究。

本研究首次将菌丝体菌落形态特征、菌丝体显微特征、锁状联合数量与菌丝体生长总量、平均生长速度、最大日生长量出现时间以及达到５０％总生长量的平均生长天数相结合，更好地反映了菌丝体生长的动态变化特征以及生长势强弱，为开展野生食用菌种质资源评估提供了有效的评价指标。

多脂鳞伞对不同性质的氮源采用了不同的氮代谢途径，表现出对不同类型的含氮物质的利用速率和利用效率的差异，且具有氮源利用的多样性特征。有机氮、无机氮、氨基酸类物质均能显著影响菌丝体的生长，在牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、谷氨酰胺和天门冬氨酸共计９种的适宜氮源条件下，多脂鳞伞的菌丝体表现出生长速度快、活力强、长势整齐的特征。

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