高效异养硝化细菌的分离筛选及多样性分析

胡 甜１，江林峰１，陈青云１，余知和１，毛 涛2，李 利１

（１． 长江大学生命科学学院/荆楚特色食品研发中心，湖北 荆州 ４３４０２５；2． 中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 ４３０２２３）

摘要：采用生长曲线指导的富集培养法，从生活污水排放渠中分离筛选出高效异养硝化细菌，并对其多样性进行了分析。结果显示，从分离得到的２７株异养硝化细菌中筛选出６株高效菌株Ｎｉ１－２、Ｎｉ１－８、Ｎｉ２－５、Ｎｉ２－７、Ｎｉ３－１和Ｎｉ３－４，其４８ ｈ氨氮去除率分别为８８．９％、７６．６％、８７．７％、９３．１％、９９．２％和９１．４％；结合菌落形态、革兰氏染色反应、扫描电镜观察和１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，发现菌株的种类较为丰富，初步确定Ｎｉ１－２和Ｎｉ１－８为节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ），Ｎｉ２－５和Ｎｉ３－１为产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ），Ｎｉ２－７为无色杆菌属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ），Ｎｉ３－４为芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）。该结果可为高效异养硝化菌的分离筛选及其多样性分析提供参考。

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关键词 ：异养硝化；节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）；产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）；无色杆菌属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）；芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）

中图分类号：Ｘ７０３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1181-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.039

收稿日期：２０１４－１０－０９

基金项目：湖北省科技支撑计划项目（２０１３ＢＣＢ００９）；湖北省高校青年教师深入企业行动计划项目（ＸＤ２０１４０６８）；湿地生态与农业利用教育部

工程研究中心开放基金项目

作者简介：胡 甜（１９９３－），女，湖北仙桃人，在读本科生，（电话）１５１７１１３４２０９（电子信箱）２４６６４７５６７８＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，李 利（１９８３－），讲师，

主要从事食品微生物和环境微生物教学和研究，（电话）０７１６－８０６６７１２（电子信箱）ｌｉｌｙ２０１２＠ｙａｎｇｔｚｅｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。

随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，未经适当处理的含氮废水，如生活污水、工业、种植业及禽畜养殖业废水等，大量排放入江河湖泊，造成了越来越严重的水体富营养化问题，危害到农业、渔业、旅游业等诸多行业，对饮水卫生和食品安全也构成了巨大威胁。近年来，国内外在脱氮微生物菌株的筛选和培育研究方面非常活跃，一些异养硝化菌、好氧反硝化菌、自养反硝化菌、厌氧氨氧化菌等非传统脱氮微生物不断被发现［１－４］，为研究开发经济有效的氮污染物净化技术提供了新的理论和思路。

异养硝化菌是指在好氧条件下能将氨氮或还原态有机态氮氧化成羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的一类微生物［５］。异养硝化微生物的发现，是对传统硝化理论的丰富与突破，特别是一些异养硝化微生物同时具有好氧反硝化的特性，可实现同步硝化反硝化的全新脱氮工艺［６］。因此，异养硝化微生物的重要性日益受到关注［７－１０］。

异养硝化微生物种类繁多，分布于藻类、放线菌、真菌和细菌中［７］。由于其遗传背景的差异性，不同的异养硝化微生物的生长及硝化特点都有所不同［６］。并且异养硝化菌可以利用的基质范围广泛，如铵、胺、酰胺、Ｎ－烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，这使得异养硝化机理到目前仍不清楚，其代谢途径也未被确定和证实［１１］。从自然环境中分离不同的异养硝化菌，对研究异养硝化途径和异养硝化微生物多样性，以及开发新型高效脱氮工艺具有重要意义。为此，本研究通过四级富集培养法从生活污水排放渠中分离筛选高效异养硝化细菌，分析其多样性，为异养硝化菌的理论研究和应用研究提供材料。

１ 材料和方法

１．１ 环境样品

采集排污沟渠距水面１０ ｃｍ处的水样以及其附近１０ ｃｍ深度的土样。采样后立即用于异养硝化细菌的筛选。

１．２ 培养基

富集培养基（ｐＨ ７．０）：Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３ ５．００ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．２４ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．００ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ７．８５ ｇ，ＮａＣｌ ０．５０ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．０５ ｇ，微量元素溶液［１２］ １ ｍＬ，补充去离子水至１ Ｌ。用于异养硝化菌的富集培养。

异养硝化培养基（ｐＨ ７．０）：Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３ ７．５０ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．６６ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ３．７ ｇ，其余成分同富集培养基。固体培养基添加１．５％的琼脂。用于异养硝化菌的分离纯化及氨氮去除能力研究。

牛肉膏蛋白胨培养基（ｐＨ ７．２）：牛肉膏 ５ ｇ，蛋白胨 １０ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，补充去离子水至１ Ｌ。固体培养基添加１．５％的琼脂。用于菌株的形态观察、保存及活化。

１．３ 异养硝化菌的筛选

１．３．１ 富集培养 取土样１０ ｇ或水样１０ ｍＬ加入到９０ ｍＬ含有玻璃珠的无菌水中，震摇３０ ｍｉｎ使样品充分分散。取上清５ ｍＬ接种到９５ ｍＬ富集培养基中，于３０ ℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ摇床震荡培养，每隔２ ｈ测定富集液的ＯＤ６００ ｎｍ绘制生长曲线，在稳定期初期转接２０ ｍＬ培养液至８０ ｍＬ新鲜的富集培养基中继续培养，连续转接４次。富集期间定期检测培养液中氨氮含量，若氨氮显著减少，表示富集液中含有硝化微生物，可用于后续分离纯化试验。

１．３．２ 分离纯化 取富集培养液作梯度稀释，涂布固体异养硝化培养基平板，３０ ℃培养３ ｄ，挑取不同形态的菌落接种到液体异养硝化培养基中，３０ ℃震荡培养３６ ｈ，检测培养液中氨氮的含量，将氨氮去除率较高的培养液再次稀释涂布平板进行分离和筛选，直到得到氨氮去除效果较好的纯培养菌株。

１．４ 菌株的多样性分析

１．４．１ 形态观察 将分离得到的菌株涂布牛肉膏蛋白胨平板，３０ ℃培养２ ｄ，观察菌株的菌落形态、革兰氏染色反应以及扫描电子显微镜下的细胞形态。

１．４．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增、测序和系统发育分析 用细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取菌株的基因组ＤＮＡ作为模板，采用通用引物［１３］ ２７Ｆ（５′－ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ－３′）和１４９２Ｒ（５′－ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ－３′）进行１６Ｓ ｒＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增。扩增体系（５０ μＬ）：１０×Pｆｕ Bｕｆｆｅｒ ５ μＬ， ２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ μＬ， １０ μｍｏｌ／Ｌ引物各２．０ μＬ， 基因组ＤＮＡ ５０ ｎｇ，Ｐfu ＤＮＡ聚合酶 ２ Ｕ，加ｄｄＨ２Ｏ至５０ μＬ。ＰＣＲ反应条件：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ２ ｍｉｎ，２８个循环；７２ ℃ ８ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物的纯化和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测序所获序列在ＮＣＢＩ核酸数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析，下载部分相似性高的序列及一些常见的异养硝化细菌和自养硝化细菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列，利用ＭＥＧＡ ５．１软件中基于Ｋｉｍｕｒａ ２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型的Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ （ＮＪ）邻接法构建系统发育树［１４］。

１．５ 氨态氮（ＮＨ４＋－Ｎ）的检测

定性检测：取６００ μＬ待测样品于比色板上，滴加５０ μＬ钠氏试剂，呈黄色，则培养液中含氨氮，颜色越深，氨氮含量越高。

定量检测：采用国家环境保护标准《水质氨氮的测定—钠氏试剂分光光度法》（ＨＪ ５３５－２００９）。

２ 结果与分析

２．１ 菌株的分离纯化

通过生长曲线指导的四级富集培养得到氨氮残留量较少的培养液，对稀释后的培养液进行涂布平板分离和连续多次划线纯化，成功获得具有异养硝化能力的异养型菌株共２７株，分别编号为Ｎｉ１－１—Ｎｉ１－１３，Ｎｉ２－１—Ｎｉ２－９，Ｎｉ３－１—Ｎｉ３－５。

２．２ 菌株的筛选

将分离纯化后的菌株在异养硝化培养基中培养３ ｄ，各取６００ μＬ培养液于白色的比色板上，用定性检测方法检测氨氮的去除情况，结果见表１。由表１可知，菌株Ｎｉ１－２、Ｎｉ１－８、Ｎｉ２－５、Ｎｉ２－７、Ｎｉ３－１、Ｎｉ３－４培养液用纳氏试剂显色后颜色较浅，表明培养液中氨氮残留量较少，这６株菌株的异养硝化能力较强。

２．３ 菌株的氨氮去除率

将筛选得到的６株异养硝化能力较强的菌株接种于液体异养硝化培养基中，３０ ℃ ６０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ， 检测氨氮浓度的变化， 结果显示６株菌株的氨氮去除效果较好（表２），氨氮去除率为７６．６％～９９．２％。

２．４ 菌株的多样性分析

２．４．１ 形态学分析 将活化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中３０ ℃培养２ ｄ后，分别观察其菌落形态、菌体细胞形态和革兰氏染色反应。结果显示，６株菌株在菌落大小、颜色、形状、边缘、表面光泽、透明程度、以及菌体细胞大小和形态方面的差异明显（表３，图１和图２），呈现出较好的多样性。

２．４．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析 用引物２７Ｆ和１４９２Ｒ对６株菌株的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并测序，均得到长约为１．５ ｋｂ的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列，将所获序列提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，登录号见表４。用ＢＬＡＳＴ程序与ＧｅｎＢａｎｋ中核酸数据库进行同源性分析，发现Ｎｉ１－２、Ｎｉ１－８、Ｎｉ２－５、Ｎｉ２－７、Ｎｉ３－１、Ｎｉ３－４的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分别与Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ５１１８ （ＪＸ５６６６３６）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｗ１（ＥＵ３３９９３０）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＴＺＱ４ （ＨＱ１４３６２７．１）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＳＲ４（ＫＣ５７７５４５）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｂ＿ＩＶ＿２Ｌ１０ （ＪＦ７１０９５６．１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＣＧＭＣＣ ２８７６ （ＧＱ１４８８１７．１）的一致性均达９８％以上（表４）。利用ＭＥＧＡ５．１软件中基于Ｋｉｍｕｒａ２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型的Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ （ＮＪ）邻接法构建系统发育树见图３。从图３可知，６株菌株聚为４个类群，其中Ｎｉ１－２和Ｎｉ１－８与节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）的亲缘关系较近，Ｎｉ３－４与芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）的亲缘关系较近，Ｎｉ２－７与无色杆菌属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）的亲缘关系较近，Ｎｉ２－５和Ｎｉ３－１与产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）的亲缘关系较近。

３ 小结与讨论

传统氮循环理论认为，执行硝化作用的微生物是一群生长缓慢的化能自养型硝化细菌［１０］。自１９４９年Ｑｕａｓｔｅｌ等［１５］以丙酮肟作为选择性培养基，首次分离获得异养硝化菌株以来，异养硝化微生物和异养硝化作用引起研究者们的广泛关注。研究发现，与自养硝化细菌相比，虽然异养硝化细菌单位菌体的硝化活性低，但其生长速率快，在有大量有机物存在条件下，对氧气和营养物的竞争比自养细菌强，容易成为优势菌，而且异养硝化细菌对高浓度氨氮的耐受性强［１０，１６］，因此异养硝化细菌对污水中氨氮的净化作用不可小觑。

本研究在富集培养异养硝化细菌时，用生长曲线指导富集培养的时间，在对数生长结束后立即进行转接，使自养硝化菌来不及充分生长而快速被淘汰，从而增加分离异养硝化菌的成功率。在初筛时，以钠氏试剂为指示剂对氨氮进行定性检测，在操作上简单快速，可大大提高筛选效率。

目前报道的异养硝化细菌有粪产碱杆菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）［１７］、施氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）［１８］、恶臭假单胞菌（Ｐ． ｐｕｔｉｄａ）［１９］、醋酸钙不动杆菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）［１］、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［２０］、泛养硫球菌（Ｔｈｉｏｓｐｈａｅｒａ ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈａ）［２１］、球形节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）［２２］、脱氮副球菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）［２３］等。通过１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，本研究从１份环境样品中筛选得到４个不同属的高效异养硝化细菌共６株，结合菌落形态、革兰氏染色反应、扫描电镜观察和１６ｓ ＤＮＡ序列的比对分析，初步确定Ｎｉ１－２和Ｎｉ１－８为节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ），Ｎｉ２－５和Ｎｉ３－１为产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ），Ｎｉ２－７为无色杆菌属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ），Ｎｉ３－４为芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），菌株的种类较为丰富。该结果可为高效异养硝化菌的获得及其多样性分析提供参考。

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［２２］ ＫＵＲＯＫＡＷＡ Ｍ， ＦＵＫＵＭＯＲＩ Ｙ， ＹＡＭＡＮＡＫＡ Ｔ． Ａ hｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ－cｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ rｅｄｕｃｔａｓｅ oｃｃｕｒｓ ｉｎ ｔｈｅ hｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ nｉｔｒｉｆｉｅｒ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １９８５， ２６（７）： １４３９－１４４２．

［２３］ ＣＲＯＳＳＭＡＮ Ｌ Ｃ， ＭＯＩＲ Ｊ Ｗ， ＳＰＩＲＯ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ， １９９８， ２６（３）： ２０８．

（责任编辑 龚 艳）