响应面法对超声波-螯合剂辅助提取石榴子多酚的优化

郭庆贺，吕远平

（四川大学轻纺与食品学院，成都 ６１００６５）

摘要：以石榴（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ．）子为研究对象，以多酚得率为评价指标，通过单因素试验和响应面法分析，确定超声波－螯合剂辅助提取石榴子多酚的最佳工艺条件为乙醇体积分数５０％、提取温度６０ ℃、提取时间６０ ｍｉｎ、料液比１∶３１（m ： v）、螯合剂六偏磷酸钠添加量０．１５％。在此条件下，石榴子多酚得率可达９．３７５ ｍｇ/ｇ。通过响应面法优化得出的回归方程具有一定的实践指导意义，为石榴子资源的开发提供了参考。

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关键词 ：石榴（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ．）子；多酚；提取；响应面分析

中图分类号：Ｓ６６５．４+S 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０５－1159－０4

ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．0５．０33

收稿日期：２０１４－０８－０８

作者简介：郭庆贺（１９８９－），男，河南周口人，在读硕士研究生，研究方向为农产品深加工及工程化，（电话）１８７８００９５５９６（电子信箱）

４９１８８５２４４＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，吕远平（１９７１－），女，副教授，博士，主要从事食品科学与工程方面的研究，（电子信箱）３６４９４３４７７＠ｑｑ．ｃｏｍ。

石榴（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ Ｌ．）为石榴科石榴属，石榴果实的各部分均含有丰富的生物活性物质［１］，是食品、药品、保健品等天然活性成分的可靠来源［２］。石榴子是石榴的重要部位，研究表明石榴子多酚在预防和治疗心脑血管疾病、肿瘤等方面有显著效果［３］。近年来，多酚在保健品行业受到关注［４］，石榴子多酚提取物的抗氧化作用强于维生素Ｅ［５］，因此石榴子多酚的开发具有十分重要的意义［６］。

目前，对石榴子多酚提取的研究中，多种辅助提取技术得以采用［７－１０］，但鲜见超声波－螯合剂联合辅助提取石榴子多酚的报道。本试验采用超声波－螯合剂联合辅助提取石榴子多酚，以提高石榴子多酚提取率，通过响应面分析法对提取工艺条件进行优化，以期为石榴子资源的开发提供依据。

１ 材料与方法

１．１ 材料与仪器

石榴子：御庄生态绿色产业有限责任公司提供。

没食子酸标准品（上海源叶生物科技有限公司）；碳酸钠、无水乙醇、六偏磷酸钠、福林酚试剂等均为分析纯（成都科龙化工试剂厂）。

４１０ＨＴ型超声清洗机（深圳科利尔电子科技有限公司）；ＥＳＪ２１０－４Ａ型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；ＵＶ－２０００型紫外可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；ＬＤ－Ｙ３００Ａ型粉碎机（永康顶帅五金制品有限公司）；ＬＤ４－２Ａ型离心机（北京医用离心机厂）；ＲＥ－５２ＡＡ型旋转蒸发器（上海市青浦沪西仪器厂）。

１．２ 方法

１．２．１ 石榴子多酚提取工艺流程 原料→烘干→粉碎（过４０目筛）→加入提取溶剂→超声波处理→离心（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ，１０ ｍｉｎ）→抽滤→减压蒸馏浓缩至原体积的１／４→蒸馏水定容至１００ ｍＬ→多酚提取液。

１．２．２ 单因素试验 各单因素试验均称取１．００ ｇ石榴子粉末。①在料液比１∶２５（石榴子粉末质量与乙醇溶液体积比，下同）、温度５０ ℃、提取时间４０ ｍｉｎ且不添加螯合剂六偏磷酸钠的条件下，选取不同乙醇体积分数（２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％）进行单因素试验；②在乙醇体积分数５０％、料液比１∶２５、提取时间４０ ｍｉｎ且不添加螯合剂的条件下，选取不同提取温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０ ℃）进行单因素试验；③在乙醇体积分数５０％、温度５０ ℃、提取时间４０ ｍｉｎ且不添加螯合剂的条件下，选取不同料液比 （１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０、１∶３５）进行单因素试验；④在乙醇体积分数５０％、料液比１∶２５、温度５０ ℃且不添加螯合剂的条件下，选取不同提取时间（２０、３０、４０、５０、６０、７０ ｍｉｎ）进行单因素试验；⑤在乙醇体积分数５０％、料液比１∶２５、温度５０ ℃且提取时间６０ ｍｉｎ的条件下，选取不同螯合剂添加量（０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％）进行单因素试验。通过单因素试验，研究各单因素对石榴子多酚得率的影响。

１．２．３ 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，选取对石榴子多酚得率影响较大的３个因素（料液比、提取时间、螯合剂添加量）进行响应面优化试验［１１］，以石榴子多酚得率为评价指标，确定超声波－螯合剂辅助提取石榴子多酚的最佳工艺条件，试验因素及水平见表１。

１．２．４ 标准曲线的绘制 分别量取标样没食子酸溶液（１００ ？滋ｇ／ｍＬ）０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ ｍＬ于１０ ｍＬ棕色容量瓶中，加入５．０ ｍＬ １０％福林酚试剂，反应５ ｍｉｎ后加入４．０ ｍＬ ７．５％的Ｎａ２ＣＯ３溶液，定容后摇匀，室温放置１ ｈ后，测定溶液在７６５ ｎｍ处的吸光度［１２］。没食子酸标准曲线的回归方程为Ｙ＝０．０８２Ｘ＋０．００１，Ｒ２＝０．９９９，式中Ｙ为吸光度，Ｘ为没食子酸含量（？滋ｇ／ｍＬ）。

１．２．５ 石榴子提取液中多酚得率的测定 吸取１ ｍＬ已稀释的提取液于１０ ｍＬ棕色容量瓶中，按照上述标准曲线绘制中的方法反应后，测定溶液在７６５ ｎｍ处的吸光度。将吸光度代入标准曲线方程并按以下公式计算样品中的多酚得率。

ω＝（Ｃ×Ｖ×Ｎ）/（１ ０００×Ｍ）

式中，ω为多酚得率（ｍｇ／ｇ）；Ｃ为没食子酸含量（？滋ｇ／ｍＬ）；Ｖ为提取液体积（ｍＬ）；Ｎ为稀释倍数；Ｍ为样品质量（ｇ）。

２ 结果与分析

２．１ 乙醇体积分数对石榴子多酚得率的影响

乙醇体积分数对石榴子多酚得率的影响结果见图１。从图１中可以看出，随着乙醇体积分数的增加，石榴子多酚得率先增加后逐渐降低，当乙醇体积分数为５０％时多酚得率最大，达到９．０１ ｍｇ／ｇ，提取效果最好。根据相似相溶原理，提取溶剂的极性与多酚的极性越接近，对多酚的提取效果就越好，故选用５０％为最佳的乙醇体积分数。

２．２ 提取温度对石榴子多酚得率的影响

提取温度对石榴子多酚得率的影响结果见图２。由图２可知，随着提取温度的升高，石榴子多酚得率逐渐升高，当提取温度为６０ ℃时，石榴子多酚得率达到９．１１ ｍｇ／ｇ，高于６０ ℃后多酚得率趋于不变。可能是适宜的温度可以降低提取溶剂的粘度，促进多酚在提取液中的扩散，但是随着提取温度的升高，会对多酚物质中热敏性的活性成分产生影响，且能耗也会增加。综合考虑，确定６０ ℃为最佳提取温度。

２．３ 料液比对石榴子多酚得率的影响

料液比对石榴子多酚得率的影响结果见图３。图３表明，随着溶剂用量的增大，石榴子多酚得率逐渐提高，当料液比为１∶２５时，石榴子多酚得率达到８．４８ ｍｇ／ｇ，低于１∶２５后多酚得率提高不明显。这是因为在料液比达到１∶２５后，石榴子中的多酚大部分已被提取出来，此后随着溶剂用量的增加，多酚得率变化趋于平缓。随着溶剂使用量的增加，后续分离提纯的成本也逐渐增加。综合考虑，以料液比１∶２５、１∶３０、１∶３５继续对多酚的提取做响应面分析，以确定最佳料液比。

２．４ 提取时间对石榴子多酚得率的影响

提取时间对石榴子多酚得率的影响结果见图４。如图４所示，随着提取时间的延长，石榴子多酚得率逐渐提高，当提取时间为５０ ｍｉｎ时石榴子多酚得率达到８．５７ ｍｇ／ｇ，高于５０ ｍｉｎ后多酚得率趋于不变。这是因为在提取时间达到５０ ｍｉｎ后，石榴子中的多酚大部分已被提取出来，此后随着提取时间的延长，多酚得率变化趋于平缓。随着提取时间的延长，提取效率降低，成本也逐渐增加。综合考虑，以提取时间５０、６０、７０ ｍｉｎ继续对多酚的提取做响应面分析，以确定最佳提取时间。

２．５ 螯合剂添加量对石榴子多酚得率的影响

螯合剂添加量对石榴子多酚得率的影响结果见图５。从图５中可以看出，螯合剂六偏磷酸钠添加后，石榴子多酚得率有所提高，添加量为０．１％时多酚得率已达到９．３０ ｍｇ／ｇ；但是随着螯合剂添加量的增大，多酚得率逐渐降低。这是因为螯合剂六偏磷酸钠能与多价金属离子络合形成可溶性金属络合物，能与有机大分子竞争金属离子，从而使有机大分子游离出来，有利于多酚的提取；但是如果螯合剂添加量过大，会结合提取液中的水分，使提取液极性降低，导致多酚在提取液中溶解度降低。综合考虑，以螯合剂添加量为０．１％、０．２％、０．３％继续对多酚的提取做响应面分析，以确定最佳螯合剂添加量。

２．６ 响应面优化试验结果

Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验结果见表２。使用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８．０软件对表２的数据进行处理，得到表３回归分析结果，利用软件进行非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型为Ｙ＝０．５１３ ８７５Ａ＋０．９３４ ７５Ｂ＋１０．７２５Ｃ－０．０００ ０５ＡＢ－０．０３５ＡＣ－０．０４ＢＣ－０．００４ ２１２５Ａ２－０．０１５ ２５Ｂ２－２４．３７５Ｃ２－２１．０７５。

回归方差分析显著性检验表明，该模型回归极显著（Ｐ＜０．０００ １），失拟项不显著，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可用于石榴子多酚提取工艺试验的预测。方程的一次项中Ｂ、Ｃ对响应值的影响达显著和极显著，二次项对响应值影响均达极显著水平，表明各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。方差分析中，ＦＡ＝０．００５ ４７７，ＦＢ＝６．７０９ ７０３，ＦＣ＝１８９．４９３，即各因素对多酚得率的影响程度大小顺序为螯合剂添加量、料液比、提取时间。

根据回归方程得到各因素交互作用响应面分析图（图６、图７、图８）。在模型浓度范围内选择出发点，使用快速上升法进行优化，得到的石榴子多酚提取的最佳方案为提取时间５９．６８ ｍｉｎ，料液比１∶３０．８０，螯合剂添加量０．１５％，多酚得率９．３８３ ｍｇ／ｇ。考虑到实际操作，将提取工艺参数修正为提取时间６０ ｍｉｎ、料液比１∶３１、螯合剂添加量０．１５％。以上述条件进行３次验证试验，石榴子多酚得率的平均值为９．３７５ ｍｇ／ｇ，与理论预测值相比，其相对误差约为０．０９％，表明得出的回归方程具有一定的实践指导意义。

３ 小结

采用超声波－螯合剂辅助提取的方法对石榴子中多酚进行提取，在单因素试验的基础上，通过响应面分析对其提取工艺进行优化，拟合出合理的回归模型，可较好地预测石榴子中多酚得率。确定超声波－螯合剂辅助提取石榴子多酚的最佳工艺条件为乙醇体积分数５０％、提取温度６０ ℃、提取时间６０ ｍｉｎ、料液比１∶３１、螯合剂六偏磷酸钠添加量０．１５％。在此条件下，石榴子多酚得率可达９．３７５ ｍｇ／ｇ。通过响应面优化得出的回归方程具有一定的实践指导意义，可以为石榴子资源的开发提供参考。

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（责任编辑 赵娟）