猪囊尾蚴的实验室诊断

董杰

（黑龙江省拜泉县长春镇畜牧兽医站 164724）

1酶联免疫吸附试验

抗原采用猪囊尾蚴的囊液，经亲和层析纯化、浓缩、分装后，于-20℃保存，使用前，用0.1M pH值9.6醋酸盐缓冲液稀释，使蛋白含量为30毫克/分升.酶结合物用兔抗猪IgG免疫血清，经硫酸铵盐析沉淀，再经DEAE?纤维素纯化提取免疫抗猪IgG抗体，用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，经酶活力测定，应用时最适稀释浓度为1∶1000。

操作方法为，以40孔聚苯乙烯微量反应为固相载体，每凹孔加稀释抗原液0.2毫升，置于4℃冰箱过夜，或30℃2小时，用pH值7.4PBS?吐温20洗涤3次，每次3分钟，抽干，加以PBS?吐温20稀释的被检血清0.2毫升，同份血清同同时试验2孔，置于37℃水浴箱孵育30分钟，同前洗涤，加1∶1000稀释的酶结合物0.2毫升，37℃水浴箱孵育30分钟，同前洗涤，加底物过氧化氢?邻苯二胺溶液0.2毫升，37℃15分钟后加2M硫酸0.05毫升终止反应。之后，将微量反应板移入酶标记光度计内，于492纳米波长测定光密度（OD值），每次试验均设置阳性阴性参考血清和PBS?吐温20空白对照。以参考阳性血清的OD值作0.1.待测血清的OD值大于或等于阳性参考血清的OD值时为阳性，低于此值为阴性。阳性猪反应液呈鲜明的橙黄色，阴性猪反应液呈浅的淡黄色，两者眼观对比有明显差别，易于判定。经反复试验，选定抗原的稀释度为30微克/毫升，血清稀释度为1∶50。

间接血凝集试验是一种敏感度很高的血清学试验，在猪囊尾蚴病的诊断上取得了很好的效果。从新鲜的猪囊尾蚴猪肉剥离整个虫体，吸取囊液混合后离心沉淀，取上清液即为囊尾蚴液抗原。用2.5%戊二醛处理过的2.5%鞣酸化羊红细胞与等量稀释的囊尾蚴液抗原混合，于37℃水浴中搅拌30分钟，离心去上清液，磷酸盐缓冲液洗3次，再悬浮于含2%灭活兔血清的磷酸盐缓冲液中，制成1%羊红细胞悬浊液即为致敏羊红细胞，4℃保存备用。将2.5%鞣酸化羊红细胞离心去上清液，用含2%灭活兔血清的磷酸盐缓冲液制成1%羊红细胞悬液，作为对照羊红细胞，4℃保存备用。

取受检血清0.05毫升，加9倍量的对照羊红细胞放室温10分钟，以吸收嗜异性抗体。离心沉淀后，取上清液，即为1∶10受检血清，再用磷酸盐缓冲液稀释为1∶50。每份受检的稀释血清，用9支试管作2倍递减稀释：向1、2、9三支试管内各加入上述稀释血清0.1毫升，向2~8管各加入磷酸盐缓冲液0.1毫升，从第2管吸出0.1毫升放入第3管，同法依次稀释至第8管，最后从第八管吸出0.1毫升弃去，使1~8管分别含1∶50，1∶100，1∶200，……1∶6400的稀释血清0.1毫升，第9管作为血清对照管。第1~8管加致敏羊红细胞1滴（0.05~0.06毫升），第9管加对照羊红细胞1滴，充分混匀后，放置室温内静置2~3小时，待红细胞完全沉淀后记录结果。

效价测定：依凝集程度分为0，0.25，0.50，0.75和100%共5个等级，分别以0、1、2、3、4数字代替。管底出现均匀紧密的颗粒性凝集、细边，红细胞沉集范围小于管底直径的2/3而仍大于1/2，即为3级凝集；若只有少量凝集，但边缘加粗，红细胞沉集范围等于管底直径的1/2者为2级凝集；同上，但其红细胞沉集范围小于管底直径的1/2者，为1级凝集；完全不凝集，管底中心呈清楚的暗红钮状者为0级。凡受检血清稀释1∶50或更大，仍发生超2级反应者确定为囊尾蚴病间接血凝试验阳性，而对照均应为阴性，否则应当重做。

2环状沉淀反应

用新鲜的猪囊尾蚴经过丙酮、乙醚的处理，取其干燥的虫粉以生理盐水浸渍24小时后，经细菌滤斗过滤所制备的抗原，稀释到4000倍具有诊断价值，但阳性反应的滴度可高达3200倍。

为提高抗原的特异性，除了注意和防止可能出现的某些非特异性干扰因素外，进行了硫酸铵分层和荧光分析，其方法是将新鲜猪囊尾蚴的全虫置于荧光灯的暗室，在紫外光的照射下发出明亮的红色荧光。如分成头节、囊液和囊膜3部分，分别进行荧光检查，则只有囊液可以观察到明亮的荧光物质。为了从囊液中提取此荧光物质，用酒精混于囊液中，可将此物同蛋白质一样沉淀出来，取此沉淀物再进行荧光检查，可见强烈的荧光。再将此有强烈荧光的沉淀物用各种不同的饱和程度的硫酸铵进行分层，析出不同的沉淀，再作紫外荧光的比较分析。