学龄期儿童慢性肾脏病心理行为问题现状调查分析及PFCC干预效果的研究

【摘要】目的：探索人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）提取的多系分化持续应激细胞（Muse细胞）对神经炎症微环境的抑制作用。方法：用脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞炎症反应后，收集hBMSCs细胞与Muse细胞上清液（CM）培养小胶质细胞，分为对照组、LPS组、BMSC-CM组、Muse-CM组。采用实时荧光定量PCR的方法检测小胶质细胞炎症反应水平。结果：Muse细胞上清液培养的炎症预刺激小胶质细胞促炎因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而抗炎标记物Arg-1的表达水平显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：Muse细胞可以在一定程度上抑制神经炎症微环境，促使小胶质细胞向抗炎表型转变，对神经炎症性疾病有应用价值，值得进一步研究。

【关键词】骨髓间充质干细胞　Muse细胞　神经炎症　抑制作用

在一些神经退行性疾病中，小胶质细胞由于过度活化会释放促炎因子，通过级联反应使神经炎症反应增强，从而进一步损伤神经系统。因此，目前许多研究致力于促使炎症环境中的小胶质细胞向M2型转变［1］，从而降低炎症微环境中促炎因子的表达，增加抑炎因子含量，缓解炎症损伤程度。

干细胞可以在神经系统中起神经保护作用，且在多系统中都具有一定的抗炎能力。多系分化持续应激细胞（multilineage differentiating stress enduring cell，Muse cell）可以从脂肪细胞、骨髓细胞等多种细胞中提取，是一种新型耐受性干细胞，目前多应用于细胞移植相关的疾病中，尤其是具有在组织修复过程中能大量分化为周围组织细胞的特点［2］，为修复提供种子细胞。

目前，Muse细胞在神经炎症中的抗炎作用仍鲜有报道，故本研究通过Muse细胞上清液与炎症性小胶质细胞的反应，探索其在神经系统疾病中的抗炎效果，评估其在神经炎症治疗中的可行性，为神经炎症相关疾病提供新的种子细胞。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

大鼠小胶质细胞系HAPI（ 深圳市豪地华拓生物科技有限公司）；脂多糖（LPS，美国Sigma公司）；澳洲胎牛血清（美国Gibco公司）；DMEM/F12培养基、α-MEM培养基（美国Gibco公司）；RNA快速提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司）；逆转录试剂盒、cDNA扩增试剂盒（日本Takara公司）；大鼠抗人SSEA-3抗体（美国Abcam公司）；羊抗大鼠Alexa Fluor® 647二抗（美国Abcam公司）。

1.2 Muse细胞的获取与鉴定

从人骨髓血中分离获得骨髓间充质干细胞（hBMSCs），当细胞扩增至第4代时，吸取上清液，加入胰酶进行细胞耐受8 h实验以获取Muse细胞。将Muse细胞培养于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，置于polyHEMA包被处理的6孔细胞培养板进行悬浮培养。5～6 d后取出单个Muse细胞球，采用免疫荧光的方法检测多能干细胞标志物SSEA-3表达，荧光显微镜下观察蛋白表达情况并拍照。

1.3　获取hBMSCs与Muse细胞培养上清液当hBMSCs与Muse细胞长至70%后，继续贴壁培养48 h，用15 mL无菌离心管收集培养上清液并离心（10 min，400 g），弃去沉淀，保存于-20℃冰箱中待用。

1.4 　实时荧光定量 PCR 检测肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和Arg-1 mRNA收集12孔板中的HAPI细胞，提取细胞总RNA，经酶标仪检测后，确保OD值为2.0左右，剔除不纯的细胞RNA后进行RNA逆转录，并将cDNA置于-20℃保存。使用实时荧光定量PCR试剂盒，按预变性95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s循环40次，重复3次。

1.5　统计学方法

采用spss 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1 Muse细胞原代培养与鉴定

Muse细胞从hBMSCs中分离后，贴壁培养2 d，可见细胞胞体较hBMSCs细胞更小，但也呈现纤维细胞状，胞体透亮（图1 A）。Muse细胞在悬浮培养皿中经过5 d培养可以成球，经免疫荧光鉴定，其存在多能干细胞标志物SSEA-3（图1 B）。

图1  Muse细胞原代培养与鉴定

A：P1代Muse细胞形态（×20）；B：免疫荧光检测Muse细胞表面标记物

2.2 Muse细胞上清液对炎症性小胶质细胞TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA水平的影响

实时荧光定量PCR法检测HAPI小胶质细胞中TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA的转录水平。100 ng/mL LPS刺激HAPI 6 h后洗去上清液，再将用完全培养基培养24 h的LPS组与对照组相比，TNF-α、IL-1β的mRNA水平显著增加（P＜0.01），Arg-1的mRNA水平明显降低（P＜0.01）；与LPS组相比，洗去LPS刺激液后选用干细胞上清液培养的HAPI细胞TNF-α、IL-1β的mRNA表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），但BMSCCM组与Muse-CM组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与此同时，BMSC-CM组、Muse-CM组与LPS组比较，Arg-1的mRNA表达显著升高，组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），且Muse-CM组较BMSC-CM组的Arg-1表达水平也有显著性增加，组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1  Muse细胞上清液对炎症性小胶质细胞TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA水平的影响

组别 n TNF-α mRNA IL-1β mRNA Arg-1 mRNA

对照组 3 0.80±0.19 1.04±0.18 1.06±0.12

LPS组 3 10.94±1.04① 4.23±0.29① 0.16±0.15①

BMSC-CM组 3 7.25±0.54② 2.54±0.45② 0.34±0.07②

Muse-CM组 3 6.50±1.05② 2.39±0.40② 0.52±0.76②③

注：与对照组比较，①P＜0.05；与LPS组比较，②P＜0.05；与BMSC-CM组比较，③P＜0.05。

3　讨论

中枢神经系统中的神经炎症是神经免疫学研究的重要课题。神经免疫细胞中小胶质细胞和星形胶质细胞激活进入促炎状态已被认为是几种神经退行性疾病中重要的病理特征。

小胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的单核吞噬细胞。它们是急性和慢性疾病的中枢性炎症反应的主要免疫细胞［3］。小胶质细胞被激活后会差异表达各种与促进或抑制炎症过程有关的受体，本研究选用小胶质细胞常见的促炎因子TNF-α、IL-1β以及抗炎因子Arg-1作为研究对象，以探究Muse细胞对炎症环境中的小胶质细胞炎症因子mRNA表达水平的作用。本次实验表明，hBMSCs细胞与Muse细胞对这两种促炎因子的合成都具有良好的抑制效果。Arg-1作为抗炎小胶质细胞的重要表型，其合成水平在炎症环境中被显著抑制了。本次实验发现，Muse细胞较hBMSCs细胞来说，其提升炎症环境小胶质细胞的Arg-1合成能力更强。

综上所述，Muse细胞与hBMSCs细胞类似，可以抑制炎症环境中小胶质细胞促炎因子的表达，并且可以更大程度上诱导炎症预刺激的小胶质细胞向抗炎表型转变，但其内在的免疫作用机制仍需进一步探究。

【参考文献】

［1］ KOBASHI S，TERASHIMA T，KATAGI M，et al．Transplantation of M2-Deviated Microglia Promotes Recovery of Motor Function after Spinal Cord Injury in Mice［J］．Molecular Therapy，2019，28（1）：254-265．

［2］ SHEN H，YONEDA S，YOUSEF ABU‐AMER，et al．Stem cell‐derived extracellular vesicles attenuate the early inflammatory response after tendon injury and repair［J］．Journal of Orthopaedic Research，2019，38（1）：117-127．

［3］ QIAO，YANG Q，JIA，et al．Neuroinflammation in the central nervous system：Symphony of glial cells［J］．Glia，2019，67（6）：1017-1035．