HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

高 涵1 周 涛2 张春晶1 李淑艳1 陈宏月2

1.齐齐哈尔医学院生物化学与分子生物学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院第一附属医院普通外科，黑龙江齐齐哈尔 161006

[摘要] 目的 构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法 采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1(+)载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞，获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系，G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果 成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建，为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。

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关键词 ] HO-1；真核表达载体；稳定转染

[中图分类号] R318　[文献标识码] A　[文章编号] 1672-5654（2014）09（a）-0079-02

血红素加氧酶（Heme Oxygenase,HO）有三种不同亚型：HO-1是诱导型血红素氧化酶；HO-2是组成性表达；HO-3最近才被发现，功能不清。HO-1是Wise和他的同事们最先在体外实验中发现的一种能降解血红素的酶,命名为HO-1[1]。现在人们已经认识到HO-1是氧化应激、炎症、免疫、细胞调节和信号转导中一种重要的分子。近几年对HO-1与肿瘤之间关系的研究越来越多，已经成为HO-1研究里的一个新热点[2]。从2013年12月—2014年7月为研究HO-1基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响，我们将HO-1基因克隆构建到真核表达载体上，并稳定转染到肝癌胞系HepG2中。为进一步研究HO-1与肿瘤发生机制作前期准备。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验所选用肝癌细胞系HepG2，质粒pcDNA3.1 (+)，pCAAG，胎牛血清，1640培养基，LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒，限制性核酸内切酶（BamHⅠ/EcoRⅠ），质粒提取试剂盒，G418，小鼠抗HO-1抗体，兔抗β-actin抗体，HRP标记山羊抗小鼠二抗，HRP标记山羊抗兔二抗。其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

根据HO-1基因序列设计一对引物：上游引物5ˊ- CCGGATCCTCCAGAGTTTCCGCATACAACC-3ˊ下游引物5ˊ- CGGAATTCAGAAAGGAAACACAGGGAGTGG -3ˊ。上下游引物分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。引物由美国Invitrogen公司合成。采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1(+)载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞，获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系，G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。选择T7测序引物，由上海生工生物工程有限公司进行测序。用考马斯亮兰蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度定量。

2 结果

2.1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H重组载体的鉴定

电泳图谱见图1可见，经序列测定与Genbank中的HO-1cDNA（NM010443）序列进行比对，序列完全一致，突变体也和预期完全一致。证明重组载体构建成功。

2.2 转染细胞外源性HO-1mRNA表达水平检测

结果见图2：稳定转染的6个HepG2细胞克隆可见目的条带（长度为240bp）。图3：稳定转染的4个HepG2细胞克隆中可见目的条带（长度为1122bp）。

2.3 转染细胞HO-1蛋白表达水平的检测

结果如图4所示，在分子量为32kDa附近检测出目的条带。说明实现了HO-1蛋白的过表达。

3 讨论

在以往的研究中对肝癌细胞的研究甚少，本实验选取肝癌细胞系（HepG2）做为研究对象，由于脂质体对HepG2细胞的转染效率高，能够达到70%~80%,所以在本实验中采用脂质体介导的方法进行转染。我们的实验选用的是pcDNA3.1(+)质粒载体，该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选，我们成功获得了pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H基因稳定转染的HepG2细胞系，并应用于后续研究。目前HO-1与肿瘤之间的关系仍然不是十分清楚。在Goodman AI，Hirai K，Jun Fang等人的研究中发现，某些肿瘤中能检测到HO-1高表达，抑制HO-1的表达能够抑制肿瘤的生长[3-4]；在Fang[5]等人的研究中提出HO-1的高表达具有抗氧化的作用，保护癌细胞；也有文章报导HO-1可以抑制肿瘤的生长，例如Hill[6]等人的研究中发现HO-1的表达可以抑制乳腺癌细胞的生长。HO-1的过表达与肿瘤的发展和预后存在一定联系,但目前还没有定论。在肝癌细胞中，HO-1也很可能可以转入核内通过蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-DNA相互作用调节细胞周期调控因子的表达，从而影响肿瘤的发生发展。HO-1具体是通过那些机制来调节肿瘤相关基因的表达将是我们进一步研究的重点。

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参考文献]

[1] Wise CD, Drabkin DL. Degradation of haemoglobin and hemin tobiliverdin by a new cell-free ststemobtained from the hemophagous organ of dog placenta[J].Fed Proc,1964（23）:323.

[2] Sambrook J and RussellDW.Molecular Cloning-A Laboratory Namual3 Edition[M].Cold Spring Harbor Laboratory Press,Ney york,2011.

[3] Hirai K,Sasahira T,Ohmori H,et al.Inhibition of heme oxygenase-1 by zincprotoporphyrin IX reduces tumor growth of LL/2 lung cancer in C57BL mice[J].Int J Cancer，2007（120）:500-505.

[4] Fang J,Sawa T.H.In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin: targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumo[J].Cancer Res，2010（63）:3567-3574.

[5] Hillm,Pereira V,Chauveau C,Zagani R,et al.Heme oxygenase-1 inhibits rat and human breast cancer cell proliferation: mutual cross inhibition with indoleamine 2,3-dioxygenase[J].FASEB J，2012（19）:1957-1968.

[6] Hirai H,Kubo H,Yamaya M, et al.Microsatellite polymorphism in heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to oxidant-induced apoptosis in lymphoblastoid cell lines[J].Blood，2011（102）:1619-1621.

（收稿日期：2014-07-02）

影响因子

影响因子（Impact factor，IF）是美国科学情报研究所（ISI）的期刊引证报告（JCR）中的一项数据，指的是某一期刊的文章在特定年份或时期被引用的频率，是衡量学术期刊影响力的一个重要指标。由美国科学情报研究所创始人尤金·加菲得（英语：Eugene Garfield）在1960年创立，其后为文献计量学的发展带来了一系列重大革新。影响因子即某期刊前两年发表（S, T）的论文在统计当年（U）的被引用总次数 X（前两年总被引次数）除以该期刊在前两年内发表的论文总数 Y（前两年总发文量）。这是一个国际上通行的期刊评价指标。