流感疫苗生产用MDCK细胞悬浮培养技术研究进展

乔春晓 何召庆/ 中国动物保健品有限公司

传统的流感病毒疫苗生产多采用鸡胚培养工艺，这种方法一直沿用至今，然而这种生产工艺受到许多限制：鸡胚来源受限；培养过程极易污染；成本不易降低；不能保证产品的质量稳定性等。而在未来几年，随着对流行性和季节性流感疫苗的需求越来越大，人们会迫切选择使用低成本质量高的疫苗，这也就使得以细胞培养技术生产流感疫苗成为趋势，MDCK 细胞就是适用于流感病毒疫苗生产的细胞系之一，其对流感病毒具有高度敏感性。故而研究MDCK细胞的大规模培养及制备病毒疫苗具有重大意义。其中，考虑到细胞本身的生长特性- 贴壁生长，如果采用贴壁细胞培养应用于大规模工业生产会遇到很大的难题，如细胞的消化问题，因此，使MDCK 细胞适应悬浮生长进而培养流感病毒就成为研究的重点。

一、MDCK 细胞大规模培养技术

细胞的悬浮培养可谓是理想的大规模细胞培养方式，悬浮培养技术是在生物反应器中，在人工条件下，高效率大规模的培养动物细胞进而应用于生物制品生产的技术，可根据细胞的贴壁能力分为微载体悬浮培养方式和全悬浮培养方式。

1. 微载体悬浮培养。MDCK 细胞是从犬肾分离出来的一种贴壁依赖性上皮细胞，且它具有典型的“失巢凋亡”现象，即一种特殊的细胞程序死亡，是由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的，也就是说依靠传统的驯化方式或者单纯的用机械搅拌使MDCK 细胞悬浮生长难度相当大。Van Wezel 创立的微载体悬浮培养系统开创了细胞体外大规模培养的先河，更为准确的说是使贴壁细胞大规模培养成为现实。微载体悬浮培养是一种先进的贴壁细胞培养技术，其原理是将对细胞无害的颗粒加入到生物反应器的培养液中，作为载体，使细胞能在微载体表面附着生长，同时加以持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。反应器中使用微载体是一种可以提高细胞浓度的策略，其细胞密度可达1×107 cells/ml。

采用微载体培养MDCK 细胞，结合了悬浮培养与贴壁培养的优点，包括（1）细胞贴壁表面积大大增加，培养基利用充分，细胞密度增大。（2）微载体可在搅拌停止时沉降，便于将培养基与细胞分离。（3）与方瓶贴壁培养时的代谢变化不大，正常培养基可通用等等。

但是，目前生物反应器微载体培养研究只是单批次的培养，其消化放大培养依旧是难题。且微载体培养过程中一般添加了血清，给下游纯化带来了巨大压力。采用商业无血清培养基，会大大增加企业生产成本。因此，自主开发无血清培养基进行MDCK 细胞悬浮培养是目前的发展趋势。

2. 无血清单细胞悬浮培养。我们知道，生物制品生产尤其是细胞培养方法生产病毒疫苗的过程十分严谨。细胞培养需添加血清，可是血清的加入无疑给生产后期的除杂纯化等工艺带来难度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解为成熟的HA1 和HA2，能够介导病毒囊膜和靶细胞膜结合，病毒开始繁殖，而MDCK 细胞本身不具备裂解HA 的蛋白酶类，所以常常添加胰蛋白酶来提高病毒产量，但是，细胞培养中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，这种矛盾致使MDCK 无血清培养问题更亟需解决。目前，MDCK 无血清培养已经取得了很大的进展，基本思路是在基础培养基的基础上补加各种生物活性因子来替代血清，结合细胞生长所需成分，配制出无血清培养基， 能够支持MDCK 细胞正常生长增殖。一般常见的营养添加因子有：胰岛素，人转铁蛋白，氢化可的松等等，再经过对这些添加因子的添加量的优化，最终确定无血清培养基成分。

现在，已有MDCK 细胞商业用无血清培养基，它们的成功问世解决了这一大难题。通过直接法或间接法，即：原含血清培养贴壁细胞直接消化传代换成无血清培养基培养或逐步降低血清浓度直至降到无血清培养，使MDCK 细胞适应无血清培养基，生长状态优良且能正常增殖传代。

完成了MDCK 无血清培养后，MDCK 单细胞悬浮培养仍在研究当中，有文献报道，已有驯化成功的MDCK 悬浮细胞系，但就市场应用来看，是远远不够成熟的。现阶段，驯化MDCK 细胞在适应了无血清培养基培养的基础上，对其进行单细胞悬浮培养驯化方法主要有以下几种：（1）使用硅化方瓶培养：将细胞培养方瓶先用硅化剂处理，防止了细胞的贴壁，再通过调整培养基成分，使细胞增殖；（2）使用摇床或摇瓶体系，通过外力作用，防止细胞贴壁，再对细胞进行筛选，然后扩大培养。

二、 MDCK 细胞应用于流感病毒疫苗生产

采用细胞系培养流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生产方法，市场销售的一些贴壁细胞系如Vero 细胞，MDCK 细胞是应用于流感疫苗研究最典型的哺乳动物细胞系，经研究，这些宿主细胞产生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，从相应的细胞培养生产的疫苗免疫应答效果和用鸡胚生产的疫苗一样好。MDCK 细胞应用于流感疫苗生产有很多优点：MDCK细胞易培养、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效扩增流感病毒；MDCK 细胞生产的疫苗可以应用于对鸡胚蛋白过敏的患者等等。在使用MDCK 贴壁细胞接流感病毒后，通常会有较高的细胞特异性产率；微载体悬浮培养的MDCK细胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高达9log2（1∶512）；就已知实验室用驯化出MDCK 悬浮细胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于贴壁细胞系。且已有疫苗厂商如Solvay 制药公司采用无血清培养基、微载体技术制备出了MDCK细胞流感亚单位疫苗；诺华公司制备出了由MDCK 细胞培养生产的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在过去十几年中，用动物细胞培养制备流感疫苗生产方式已经替代了传统的使用鸡胚生产方式。动物细胞培养生产流感疫苗的特征在于其灵活性和可扩展性，然而，贴壁细胞易培养但是却很难扩大生产量，而如果使用微载体提供生长表面又会大大增加其成本。所以要努力创建悬浮细胞系，特别是MDCK悬浮细胞系。

多年以来，监管部门督促行业设立无血清培养流程，以避免污染。

然而，许多市售培养基仍然需要添加物，以达到高细胞密度和最大产物产量。理想的情况是，在疫苗生产中应该使用不需添加另外的蛋白质等混合物的已知成分的培养基。这不仅会降低批次变化的风险也有利于病毒收获的下游处理。此外，疫苗生产过程可以被简化，可以直接接毒而不用更换培养基。

各种传代细胞系可用于工业生产， 如PER.C6 细胞，EB66 细胞，AGE1.CR 细胞等等，它们已经被应用于疫苗生产并且这些细胞系可以在不含动物血清的培养基中悬浮生长。还有一些悬浮生长的细胞如CHO 细胞，BHK 细胞，HEK293细胞也常常被用于重组蛋白，单克隆抗体和兽用疫苗的生产。所以悬浮MDCK 细胞系是非常有必要且可行的，因为用这种细胞生产，其生产效率和经验会增强生产过程中的稳定性，并且十分经济。MDCK 细胞无血清全悬浮培养是最终目的，既可以解决血清带来的种种不利，又可以避免使用微载体添加物带来的未知隐患，从而可以提高细胞增殖效率且降低成本，保证产品的质量。

正因如此， MDCK 细胞无血清悬浮培养方法的研究更具有跨时代的意义。有报道说，有人用siat7e 转染MDCK 细胞使其悬浮生长，并繁殖流感病毒，对MDCK 细胞进行改性处理，无疑也是一种最直接的方法。

但要真正实现简单快捷的将MDCK贴壁细胞适应到悬浮培养，并进行大规模生产，还有很长的路要走。