提高山羊痘活疫苗绵羊羔睾丸细胞产量的综合措施

张玉红 井莲娜/ 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司

羊痘( Capripox ) 又名羊“天花”, 是由山羊痘病毒属(Capripoxvirus,CPV)的痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病, 包括绵羊痘(Sheep pox,SP) 和山羊痘(Goat pox,GP)。主要表现为发热, 无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹。

接种山羊痘活疫苗是预防绵羊痘、山羊痘最为有效的方法。

山羊痘活疫苗一般采集4 月龄以内的绵羊羔睾丸制备细胞，主要在每年的3 ～ 5 月，生产季节性很强。另外，由于绵羊羔睾丸是从个体养殖户处采集，数量时多时少，不稳定，因而细胞批量时多时少，批次较多。如何在有限的时间内提高细胞产量，保证生产任务的完成，是在生产中关键的因素之一。本人经过多年的生产实践总结出一套行之有效的措施，现介绍如下：

一、严格的物品准备

1．制备细胞所用物品的清洗。包括细胞瓶、磅瓶及玻璃器皿、胶塞、胶管等物品的洗涤。

（1）玻璃器皿及细胞瓶的清洗。第一次使用的玻璃器皿及细胞瓶需先过清洁液；再用洗涤剂洗刷，然后依次用自来水、纯水、注射水冲洗，确保玻璃器皿及细胞瓶干净, 晾干待用。已用过的玻璃器皿及细胞瓶直接用洗涤剂洗涮即可。如果玻璃器皿及细胞瓶在使用一段时间后,污物（污染物）不易洗净时，可先用洗液处理后，再进行清洗。尤其注意的是细胞瓶，洗净后检查应不挂水珠；灭菌后细胞瓶内壁应洁净，无可见的刷痕。

（2）胶塞、胶管的洗涤。第一次使用的胶塞、胶管需先用2% N0H煮沸15 min，用自来水洗净，晾干，再用4% HCL 煮沸15 min 后洗净；用过的的胶塞、胶管直接洗净、晾干；各种胶塞经多次使用不易洗净时,可用洗涤剂煮沸15 min 再冲洗。

2．制备细胞所用物品的包扎、灭菌。各种物品包扎要严密，胶管包扎松紧适宜；进行高压灭菌液体的转瓶的瓶塞要塞平、塞紧、绑牢，以免液体造成污染；装箱时胶管不能折住，以免消毒不彻底；胶塞、胶管及带胶塞的大转瓶等，高压灭菌121℃ 30 min，注射器、小细胞瓶等玻璃器皿干热灭菌150℃ 2 h。3．溶液的配制、物品的准备。

（1）使用的液体如双抗、0.25％柠檬酸钠- 胰酶、7.5％ NaHCO3、Hank’s 液、乳汉液等提前配制除菌；配制过程严格按照合理的程序操作，避免混入杂质；过滤溶液时0.2um滤器进行过滤除菌，备用。

（2）试剂的保存十分重要。各种液体经过合理分装后，按不同的要求进行储存。如7.5％ NaHCO3在4℃保存；双抗-20℃冷冻保存；血清在-2 0℃保存；0. 2 5％柠檬酸钠- 胰酶也在-20℃保存。

（3）灭菌后细胞瓶应仔细挑选。羊睾丸细胞在体外贴在瓶内壁上进行生长增殖，细胞瓶的干净程度就显得至关重要。因此，细胞制备人员每次必须仔细挑选灭菌后的细胞培养瓶。

二、细胞制备过程控制的综合措施

1．减少细胞污染的措施。

（1）睾丸采集。采集羊睾丸前将睾丸及其周围的毛剪的尽量短，并用碘酒棉将皮肤上羊毛和油脂清理消毒干净；采集羊睾丸的整个过程严格无菌；汉克斯液与冷冻的双抗均放于装有冰袋的保温箱中, 开始采集睾丸组织时再取出倒于容器内，采集的睾丸组织放于加有双抗的汉克斯液的消毒好的容器中；睾丸组织采集工作结束后将容器置于装有冰袋的保温箱中, 以使睾丸组织保存在一个尽量低的温度中, 减少温度对组织活力的影响 。

（2）对人员的要求。由于羊睾丸的从采集到消化是一个从外界开放环境到室内无菌环境的转换，因此要求操作人员要熟练掌握各操作环节，时刻固记无菌操作，同时还要加强无菌意识的培养。

（3）原代细胞制备程序较多，物品准备要细致到位。电子称、剪羊睾丸内、外膜的剪刀镊子、盛装睾丸组织的容器、剔除羊睾丸内、外膜后剪碎睾丸组织的剪刀、管道、分装罩、胶塞、纱布、漏斗、血清、0.25％柠檬酸钠- 胰酶、7.5％ NaHCO3、双抗等，防止在细胞制备过程中因物品缺少导致操作人员手忙脚乱或敞口时间过长等造成细胞污染。

（4）清场工作也很重要。每次生产结束用0.5％新洁尔灭擦拭桌面和地面，清场彻底，不留死角。每月对洁净区进行两次沉降菌检测，每3 个月进行一次尘埃粒子的检测，以便能及时发现环境不达标情况的情况，防止环境不达标造成细胞污染。

（5）特殊情况的处理。如果细胞培养2 ～ 3 d 后，生长不好，营养液变红，可将营养液更换一次；若再生长2 ～ 3 d，细胞仍长不满单层，此时可淘汰该瓶细胞。

2．提高活细胞数的措施。

（ 1 ）细胞营养液。我公司多年来培养细胞时一直选用的是添加10％血清的0.5％水解乳蛋白液，培养细胞时，营养液最佳的PH 值是6.8到7.0 ，不超过7.2，低于6.8 或高于7.2 均不利于细胞生长。

（2）羔羊睾丸大小。一般情况下，睾丸大小与羔羊日龄成正比。睾丸越小，同样重量的睾丸组织制备的活细胞数越多，而在所有参数确定最佳情况下，保证活细胞数控制在100×104　-200×104 个/ml 时，分瓶数越多，细胞产量就得到了提升。

（3）胰酶的温度和PH 值。胰酶的活性与胰酶的温度和PH 值关系较大。采用热消化时，胰酶的温度和睾丸组织的温度都要预孵到3 7℃ ± 0. 5℃ 。胰酶的PH 值达到7.6 ～ 7.8。当二者兼具时，才能保证胰酶有最好的活性。另外，睾丸组织与胰酶的比例也非常重要，最佳比例是1 ：8。

（4）消化时间的把握。消化时间的长短和羊睾丸的大小、剪碎的睾丸组织块的大小有关系。羊睾丸小且组织块小则消化时间短些；反这，羊睾丸大且组织块大则消化时间长些。消化瓶中睾丸组织量多时，要每隔几分钟轻摇消化瓶一次，让胰酶和睾丸组织充分接触。以免造成消化时间过长，组织消化太过，或者消化时间太短，睾丸组织未完全分离，活细胞数受到影响。消化时间最终以睾丸组织的膨松程度决定，

（5）消化方法的选择。笔者做过多次小试，用同等重量的睾丸组织采用冷消化法可比热消化法提高近一倍的活细胞数，从而提高一倍的细胞产量。因此，消化时可采用冷消化法进行细胞的消化。

（6）操作过程中细节的控制。各种胶塞、胶管必须为药用规格, 最好用硅胶，避免再生橡胶塞对细胞的毒性作用；细胞瓶塞上的管道使用玻璃管道和硅胶管；要保证细胞的均一度。在分装细胞悬液时，必须经常摇匀细胞悬液，使各转瓶分装的细胞数量均匀一致。另外，上架前要使劲摇动细胞液，以便细胞完全分散开，防止细胞结团，不利于长成致密单层。

参考文献略