猪繁殖与呼吸障碍综合征实验室诊断技术研究进展

韩四娥 马玉峰 赵丽霞 武春芳/ 金宇保灵生物药品有限公司 　宋庆庆/ 扬州优邦生物制药有限公司

猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS） 是一种急性致死性传染病，因其发病时常伴有耳朵发紫，故又被称为蓝耳病。该病于1987 年被首次报道，始于美国的北卡罗林那州、明尼苏达州和爱荷华州和加拿大一些地区。荷兰学者于1991 年第一次分离到蓝耳病病毒（Lelystadvirus） 并进行了动物实验。随后，美国学者也同样分离到PRRSV。1993 年，中国台湾学者最早发现该病在本国开始流行，随后3 年的时间，中国大陆学者郭宝清等最早发现该病在中国大陆发生感染，并通过病毒分离培养获得PRRSV。该病可以引起母猪繁殖障碍或诱发新生仔猪呼吸系统的疾病，同时伴有继发性的细菌或病毒感染，从而导致更高的死亡率。近几年，我国多个地区均有该病的发生，我国学者姜平等于1999 年对华东地区部分省市进行了PRRSV 感染情况进行了调查，主要对江苏、上海、浙江等地，通过血清样本采集和PRRSV 抗体检测的方式进行统计，结果表明江苏省PRRSV 抗体阳性率为32%，上海和浙江分别为67%、66%，且结果显示多种病原体共感染的比例较高。因此，如何及时、准确地诊断出该病成为了防治该病的关键环节之一。现对该病主要的实验室诊断方法进行总结，以期给研究学者提供更好的研究思路。一、血清学诊断方法

1. 间接荧光抗体试验（IFA）。IFA 是目前灵敏性较高的检测PRRSV 特异性抗体的方法，以此方法可以较为准确地统计猪群中PRRSV 抗体阳性率，且具有很高的特异性。该方法最早由 Yoon 等创立并逐步被广泛地应用。我国学者彭长凌等应用制备的3 株单克隆抗 体建立了IFA 检测PRRSV 的方法，并进行了初步应用，结果表明该方法可以特异性地检测到病料涂片中的PRRSV 抗原，为疾病的诊断提供了一种新的检测方式。

2. 血清中和试验（SNT）。SNT 是一种以抗原抗体反应为主要理论基础的检测方法，具有较高的特异性，但检测目标为血清中的中和抗体，这种抗体出现时间较晚，且产生的量较低，不利于疾病的早期诊断。由于其具有很高的特异性，该方法一般可以用于不同毒株的鉴别诊断，但其应用比较不便，操作周期长、诊断成本较高、不适于快速及早期诊断，而未得到广泛的应用。

3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA 是目前应用最为广泛的一种快速诊断技术，该技术与血清中和实验相类似，均是以抗原抗体的反应为理论依据。但ELISA 可以检测早期抗体也可以检测中和抗体，因该方法能够提供早期诊断而被广泛地应用于PRRS 的诊断中。我国学者杜文金等最早于2000 年建立了PRRSELISA 诊断技术。作者利用重组杆状病毒表达PRRSV的N 蛋白作为抗原，建立了PRRS ELISA 诊断方法，并将该方法与IDEXX 公司试剂盒和间接免疫荧光方法进行了对比，结果显示该方法与IDEXX 试剂盒符合率为97.3% ；与间接免疫荧光方法（IFA） 的符合率为100%。该方法的成功应用可以对PRRSV 早期感染做出诊断，有利于该疾病的防控。

4. 其他血清学诊断技术。除上述几种常用的血清学诊断方法以外，还有一些其他的诊断技术，其中包括乳胶凝集试验（LAT）、血凝和血凝抑制试验（HA/HI）和免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）。上述试验均是根据血清学原理建立的诊断技术，在一定程度上为PRRS 的防控提供了有效地辅助作用。

二、免疫胶体金技术（Immune colloidalgold technique）

免疫胶体金技术是目前较为普遍使用的一种快速诊断技术，主要通过以胶体金富集物的显色作为指示的一种直观、快速的技术。胶体金通过正负电荷相互吸引与大蛋白分子聚合在一起，并当胶体金富集到一定程度时便会显出颜色信号，以此来诊断特异性抗原或抗体的存在。该检测技术具有高效、准确、简便、敏感度高等特点，被广泛地应用于PRRSV 抗原的检测中。

三、分子生物学诊断方法

1.PCR。聚合酶链式反应（PCR）是一种最为常见的分子生物学诊断技术，该方法同样被应用到PRRS 的实验室诊断当中。Gibert 等最早将常规RT-PCR 技术应用与PRRSV 抗原检测中。另外还有学者设计引物创建了套式RT-PCR 方法并应用于PRRSV 抗原检测，这种方法可以灵敏地区分不同来源的PRRSV 毒株，同样具有快速检测的优点。同样，PCR 作为一种最为广泛应用分子生物学技术，经过各国学者的不断更新和发展，该技术远远超越了常规PCR，其中包括多重PCR、PCR-RFLP、荧光定量PCR 等一系列实验技术，这些均被应用于PRRSV 抗原检测。

2. 基因芯片。随着人类基因组测序的完成，新技术的不断完善和发展，一批新兴的高通量基因检测技术被发展起来，其中就包括基因芯片技术。大量临床样品的采集，势必需要高通量的检测方法，在这种趋势的催生下，基因芯片技术也应用到了PRRS 及其他传染性疾病的诊断当中。我国学者高淑霞等对PRRSV、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2 型、日本乙型脑炎病毒和猪瘟6 种病毒进行基因芯片检测，应用不同病毒的特异性探针检测不同的信号，经过一次操作同时获得6 种病毒抗原的检测结果。该方法具有高效、便捷、同时检测多种疾病的优点，但因其成本相对较高，技术要求高，未能普及应用，但随着该技术的不断发展及检测成本的降低，我们相信这种高通量、高效率的检测方法肯定能够获得普遍认可及应用。

四、小结

自20 世纪90 年代以来，世界各国养猪业就倍受PRRS 的危害，同时，各国学者也在不断地对该病的诊断、防治技术进行研究，以期获得最佳的防治效果。经过20 多年的不懈努力，研究者总结创建了很多实验室诊断技术，为该疾病的防治提供了理论和实际支持。随着新技术的发展及应用，我们相信未来会有更多的高通量检测方法出现，可以为养猪业提供更为可靠的诊断手段。

参考文献（略）