纸片法药敏试验失败的原因分析及解决措施

王林果 康娟/ 普莱柯生物工程股份有限公司

兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数兽医临床实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前兽医临床应用较多的方法是纸片法，以下针对该法进行分析。

一、问题的提出

按照标准操作程序进行操作，测量出抑菌圈大小，根据药敏实验标准进行判读，获得比较敏感的药物，现场使用常常出现敏感药物得不到良好的治疗效果，或者药敏实验不敏感的药物在现场使用却能获得较好的治疗效果，这是很多从事兽医实验室工作的兽医想不明白的，是不是药敏试验做错了？还是药物是假药？又或者是药敏试验本身就不靠谱？一堆的问号让兽医工作者无所适从，那么究竟为何会有这样的结果，有了这样的结果如何改善？

二、问题分析

1. 药敏实验步骤（纸片法）。（1）无菌采集合适的病料组织，无菌接种培养皿或者肉汤进行再置于37℃温箱中培养16 ～ 24 h 增菌。（2）在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。（3）用无菌镊子将纸片（提前制备好）放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24 mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5 ～ 6片。（4）标记每种药敏纸片的名称。（5）贴完纸片的平皿15 min 后再置于37℃温箱中培养16 ～ 24 h，观察记录结果。（6）结果判读：以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。

2. 影响药敏试验结果的因素。

（1）实验本身因素。

培养基：①培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。②倾注平板时，厚度应合适（约5 ～ 6 mm），不可太薄，一般90 mm 直径的培养皿， 倾注培养基18 ～ 20 ml 为宜。③培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP 的活性。④市场提供的药敏试验的培养基缺乏严格质控，质量难以保证，建议采购质量过硬的产品或者自制培养基。

细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。市场售卖的药敏纸片缺乏严格质控，质量难以保证，建议按要求自制药敏纸片。

培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12 ～ 24 h，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2 ～ 4 h，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

（2）兽医人员的因素。

操作的问题：①标准的药敏试验需要先进行细菌的分离培养，故药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。目前常规基层兽医实验室都采用自创的简便方法（无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1 ∶ 5 加生理盐水研磨制成悬液，静置5 min，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5 min 后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小），这个方法可以快速获得结果，但结果往往也出现误差，原因一是细菌量较少，二是污染的问题很难排除，结果不一定是临床细菌所致。②自制药敏片无法保证每一片纸片所含药物有效成分均一，导致结果出现误差，建议采用牛津杯法进行实验，用精密的移液枪可以量化每个牛津杯中的药物含量。

对每种药物的药动学一知半解：在选择高敏药物时没有考虑药物的吸收途径。药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，故在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。例如新霉素肠道吸收较差，可以引起高浓度的肠道药物浓度，治疗肠道疾病是非常好的药物。

误诊、滥用药物导致病菌耐药性：绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，最常见的是大多数养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。

不了解致病菌特性：临床上存在一些营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，这些疾病是不能使用药敏试验获得结果，往往分离到的一些无关细菌导致药敏试验失败。

没有真正理解药敏试验：方法学不统一，没有标准化，随意改动药敏试验步骤，随意改动药物浓度，随意改动培养时间等。

三、解决措施

那么如何才能获得与药敏试验一致的治疗效果呢？正确的药敏试验可获得敏感性较高、价廉、易得、安全的药物进行治疗，同时减少耐药菌株产生。具体措施分享如下：

（1）正确理解抑菌圈数值：药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70% ～ 80%，所以也不能过分地依赖药敏试验，如发现疗效不显著应及时换药。

（2）定期监控本场细菌耐药性：药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。

（3）药敏试验药物选择原则：避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

（4）临床选药要慎重：①窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要轻易用两种药物联合应用。②必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。③在选择高敏药物时要考虑药物的吸收途径及其药动学，有的放矢。

（5）开展联合药敏实验：①病因不明而又危及生命的严重感染。②单一抗菌药不能有效控制的混合感染及严重感染。③长期治疗、细菌易产生耐药性的慢性感染。一般抗菌药不易透入病灶的感染。④毒性较大，联合用药减少剂量后可降低毒副反应的抗菌药。临床上出现以下情况需要联合用药，这种情况下必须进行联合药敏试验。

总之，兽医临床中纸片法药敏试验结果受到多种因素的影响，在没有标准和严格操作规程的情况下，抑菌圈的大小体现出一个细菌对药物体外的敏感度的高低，也就是说这种药物抑菌圈的有无或大小只能判断出该药对细菌有没有效果，敏感性的高低只能通过科学、严格的实验来确定。