罕见B(A)亚型血清学及基因测序分析1例
2022-06-08
摘 要：目的：分析1例罕见B(A)亚型血清学及基因测序结果。方法：对1例患者使用血型血清学鉴定，并联合基因测序分析。结果：血清学定型为B亚型A,B抗原正常，A抗原弱阳性，红细胞与抗-H反应强度高于正常B细胞，但次于O细胞。直接测序可见ABO基因第1～5外显子及第6内含子无突变，第7外显子可见突变，克隆测序明确此例患者ABO血型为ABO-B(A)04/001。结论：对于正反定型难以明确鉴定者，可考虑基因测序，提高疑难血型鉴定价值。
关键词：B(A)亚型 血清学鉴定 基因测序
ABO血型是临床应用最广泛的血型分类标准，被认为是人类最重要的红细胞血型分类系统，其在临床用血、组织器官配型与移植、法医鉴定以及基因多态性分析等应用中均存在重要意义[1]。对于ABO血型亚型的血清学鉴定，是导致正反定型不一致以及定型困难的常见原因，甚至引起血型鉴定的错判导致输血相关并发症的发生[2]。其中对于ABO血型亚型的研究近年亦见诸报道，其对血清学检测以及临床输血用血造成一定负面影响[3]。B(A)亚型作为一种罕见的ABO血型亚型，研究提示其分子机制以B等位基因于正常B基因序列出现单碱基突变，进而促进其具备编码功能活性酶能力[4]。另外，临床上B(A)亚型血清学检测时除外有B抗原特异性还具有一定程度的A抗原特异性，而影响临床血型的鉴定及配血、输血工作[5]。一旦B(A)型错误鉴定为AB型，而误用AB型红细胞则将出现严重的溶血反应，甚至危及患者生命[6]。本文主要总结本院收治的1例罕见B(A)亚型的血清学的特性，并分析其基因表达。
使用试剂：ABO型抗-A、抗-B、抗-A1、抗H、抗-D均由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供，标准红细胞、筛选红细胞由Bio-Rad公司提供，血型卡以及抗体筛查卡由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供，人源抗-A、抗-B上海血液生物医药有限责任公司提供；另外DNA提取试剂盒(In-virtrogen公司)，Exon6、Exon7测序引物、Ex-Taq酶、LA-Taq酶及载体p MD18-Tvector(Ta Ka Ra公司)，ABO基因分型试剂盒(Readygene公司)，检测用各种试剂均在有效期内。ABI3100基因测序仪(美国应用生物系统公司)、贝索离心机等。
血型血清学实验：在患者用药前留取晨起肘静脉血EDTA抗凝2 m L后送检，患者全血标本离心备用，试管法ABO正反定型检测。应用抗体筛选细胞和抗人球蛋白检测卡，确定不规则抗体阴性，直接抗人球蛋白试验阴性后，使用本研究血型血清学鉴定相关试剂进行鉴定，所有操作方法均严格按照说明书及国家标准的操作规程进行。
ABO血型基因测序：使用DNA提取试剂盒对采集的血标本实施DNA提取，使用聚合酶链式反应法对血标本ABO基因的7个外显子与侧翼内含子进行测定。引物由Ta Ka Ra公司提供，扩增产物通过凝胶电泳成像系统进行鉴别。所得数据输入Chromas系统，应用Bio Edit软件进行图谱对照结果分析。其中单倍型序列分析主要针对标本第6及第7外显子进行扩增，随后提取质粒DNA实施测序鉴定，明确标本单倍型。
ABO基因分型：直接测序可见ABO基因第1～5外显子以及第6内含子无突变，第7外显子可见526C/G、640A/G、657C/T、703A/G、796C/A、803G/C、930A/G杂合，第6外显子的261位G缺如，提示此患者基因型为B/O，但仍无法明确640位突变位点；克隆测序提示，其中1条单倍型为001,1条单倍型存在第7外显子640位碱基A>G突变，克隆测序明确此患者ABO血型为ABO-B(A)04/001。
ABO亚型是因为糖基转移酶基因第6基因及第7基因外显子位点突变，导致决定糖基转移酶氨基酸残基发生改变，出现红细胞A抗原和(或)B抗原种类与数量变化。通过血清学检测则出现正反定型不一致[10]。本研究入组者血清学检测出现正定型A弱B型，反定型则为B型，典型的正反定型不一致且无法明确血型分型，进而对此入组者进行ABO基因测序，提示第7基因外显子640位碱基A>G单碱基突变，由缬氨酸替换214位蛋氨酸，导致B等位基因出现编码双功能活性酶能力，影响酶的运转效率，在血清学为B抗原特异性同时有少量A抗原特异性，故出现B(A)亚型表现。
在B(A)与Cis AB的差别上，B(A)型红细胞中还含有少量A抗原活性且接近正常B抗原特异性，B(A)与Cis AB在血清学上因抗原水平的不同，Cis AB其A抗原表达显著强于B抗原，血清中所含弱抗B抗体可与普通B型红细胞凝集，但不与Cis AB红细胞凝集[11]。而相对于Cis AB，此例患者的B(A)血型则在血清学与遗传学上均为B亚型，同样在人群中发生率极少[12]。而当前针对B(A)亚型者输血治疗的原则尚未完全统一，多建议遵循同型输注和(或)相容性输注的原则[13],B(A)患者如作为受血者则可输同型B(A)型、O型洗涤红细胞和AB型血浆，但如B(A)亚型者含有不规则抗体则不宜作为供血者而采集血液[14]。
血型一般专指红细胞表面的抗原差异，即红细胞血型，其中ABO血型系统最为重要。血型亚型是指属同一血型抗原，但抗原结构和或抗原位点数有一定差异而引起的变化。在临床工作中ABO亚型属于“疑难血型”鉴定，是检验实验室检测能力和水平的重要方式。此例入组者，其血型最终明确为ABO-B(A)04/001亚型，通过常规血清学检测法无法明确血型定型，要通过基因分型进行鉴定[15]。对于特殊患者来说，虽血型血清学鉴定方法十分经典，但仍存在明显不足。随着基因测序技术的推广，可为ABO亚型的测定开辟新思路，有效地避免了不规则抗体、自身因素、药物因素等多重影响。对于正反定型难以明确鉴定者，可考虑使用基因测序技术，对疑难血型的检测鉴定有明确的指导价值。
关键词：B(A)亚型 血清学鉴定 基因测序
ABO血型是临床应用最广泛的血型分类标准，被认为是人类最重要的红细胞血型分类系统，其在临床用血、组织器官配型与移植、法医鉴定以及基因多态性分析等应用中均存在重要意义[1]。对于ABO血型亚型的血清学鉴定，是导致正反定型不一致以及定型困难的常见原因，甚至引起血型鉴定的错判导致输血相关并发症的发生[2]。其中对于ABO血型亚型的研究近年亦见诸报道，其对血清学检测以及临床输血用血造成一定负面影响[3]。B(A)亚型作为一种罕见的ABO血型亚型，研究提示其分子机制以B等位基因于正常B基因序列出现单碱基突变，进而促进其具备编码功能活性酶能力[4]。另外，临床上B(A)亚型血清学检测时除外有B抗原特异性还具有一定程度的A抗原特异性，而影响临床血型的鉴定及配血、输血工作[5]。一旦B(A)型错误鉴定为AB型，而误用AB型红细胞则将出现严重的溶血反应，甚至危及患者生命[6]。本文主要总结本院收治的1例罕见B(A)亚型的血清学的特性，并分析其基因表达。
资料与方法
患者，女，48岁，汉族。入院时留取静脉血EDTA抗凝2 m L测定血型出现正反定型不一致现象，既往无明确遗传病史、无输血史、无手术治疗史、无吸毒史。入组时检测输血相关传染疾病均为阴性。使用试剂：ABO型抗-A、抗-B、抗-A1、抗H、抗-D均由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供，标准红细胞、筛选红细胞由Bio-Rad公司提供，血型卡以及抗体筛查卡由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供，人源抗-A、抗-B上海血液生物医药有限责任公司提供；另外DNA提取试剂盒(In-virtrogen公司)，Exon6、Exon7测序引物、Ex-Taq酶、LA-Taq酶及载体p MD18-Tvector(Ta Ka Ra公司)，ABO基因分型试剂盒(Readygene公司)，检测用各种试剂均在有效期内。ABI3100基因测序仪(美国应用生物系统公司)、贝索离心机等。
血型血清学实验：在患者用药前留取晨起肘静脉血EDTA抗凝2 m L后送检，患者全血标本离心备用，试管法ABO正反定型检测。应用抗体筛选细胞和抗人球蛋白检测卡，确定不规则抗体阴性，直接抗人球蛋白试验阴性后，使用本研究血型血清学鉴定相关试剂进行鉴定，所有操作方法均严格按照说明书及国家标准的操作规程进行。
ABO血型基因测序：使用DNA提取试剂盒对采集的血标本实施DNA提取，使用聚合酶链式反应法对血标本ABO基因的7个外显子与侧翼内含子进行测定。引物由Ta Ka Ra公司提供，扩增产物通过凝胶电泳成像系统进行鉴别。所得数据输入Chromas系统，应用Bio Edit软件进行图谱对照结果分析。其中单倍型序列分析主要针对标本第6及第7外显子进行扩增，随后提取质粒DNA实施测序鉴定，明确标本单倍型。
结果
血型血清学检测结果：入组者血清学定型结果为B亚型A,B抗原正常，A抗原弱阳。(卡式法)正定型抗-A(1+)，抗-B(4+)，抗-A1(0)，抗-H(4+)，人源抗-A(0)，人源抗-B(3+)，反定型A1细胞(2+),B细胞(0),O细胞(0),A2细胞(0)，自身细胞(0)。(试管法)正定型抗-A(2+)，抗-B(4+)，抗-A1(0)，抗-H(2+)，人源抗-A(0)，人源抗-B(3+)，反定型A1细胞(2+),B细胞(0),Oc(0)，自身细胞(0)。红细胞与抗-H反应的强度显著高于正常B细胞，但次于O细胞。ABO基因分型：直接测序可见ABO基因第1～5外显子以及第6内含子无突变，第7外显子可见526C/G、640A/G、657C/T、703A/G、796C/A、803G/C、930A/G杂合，第6外显子的261位G缺如，提示此患者基因型为B/O，但仍无法明确640位突变位点；克隆测序提示，其中1条单倍型为001,1条单倍型存在第7外显子640位碱基A>G突变，克隆测序明确此患者ABO血型为ABO-B(A)04/001。
讨论
B(A)血型属于临床十分罕见ABO表型，部分含有高水平B型半乳糖基转移酶，高水平B型酶可将N-乙酸氨基半乳糖转移至H抗原上，与A抗原结合形成活性基团，故在B型红细胞中存在弱阳性A抗原[7]，且同一等位基因编码产物既有A抗原亦有B抗原特异性[8]。血清学检测后多以B型为常见，但少数单克隆抗-A试剂亦有一定的弱阳性反应，但其亲和力低，凝集块较快消散，血清对A1存在凝集反应，而血清中所含抗-A抗体、H抗原活性显著增强，抗-H反应强度则与O细胞相近[9]。ABO亚型是因为糖基转移酶基因第6基因及第7基因外显子位点突变，导致决定糖基转移酶氨基酸残基发生改变，出现红细胞A抗原和(或)B抗原种类与数量变化。通过血清学检测则出现正反定型不一致[10]。本研究入组者血清学检测出现正定型A弱B型，反定型则为B型，典型的正反定型不一致且无法明确血型分型，进而对此入组者进行ABO基因测序，提示第7基因外显子640位碱基A>G单碱基突变，由缬氨酸替换214位蛋氨酸，导致B等位基因出现编码双功能活性酶能力，影响酶的运转效率，在血清学为B抗原特异性同时有少量A抗原特异性，故出现B(A)亚型表现。
在B(A)与Cis AB的差别上，B(A)型红细胞中还含有少量A抗原活性且接近正常B抗原特异性，B(A)与Cis AB在血清学上因抗原水平的不同，Cis AB其A抗原表达显著强于B抗原，血清中所含弱抗B抗体可与普通B型红细胞凝集，但不与Cis AB红细胞凝集[11]。而相对于Cis AB，此例患者的B(A)血型则在血清学与遗传学上均为B亚型，同样在人群中发生率极少[12]。而当前针对B(A)亚型者输血治疗的原则尚未完全统一，多建议遵循同型输注和(或)相容性输注的原则[13],B(A)患者如作为受血者则可输同型B(A)型、O型洗涤红细胞和AB型血浆，但如B(A)亚型者含有不规则抗体则不宜作为供血者而采集血液[14]。
血型一般专指红细胞表面的抗原差异，即红细胞血型，其中ABO血型系统最为重要。血型亚型是指属同一血型抗原，但抗原结构和或抗原位点数有一定差异而引起的变化。在临床工作中ABO亚型属于“疑难血型”鉴定，是检验实验室检测能力和水平的重要方式。此例入组者，其血型最终明确为ABO-B(A)04/001亚型，通过常规血清学检测法无法明确血型定型，要通过基因分型进行鉴定[15]。对于特殊患者来说，虽血型血清学鉴定方法十分经典，但仍存在明显不足。随着基因测序技术的推广，可为ABO亚型的测定开辟新思路，有效地避免了不规则抗体、自身因素、药物因素等多重影响。对于正反定型难以明确鉴定者，可考虑使用基因测序技术，对疑难血型的检测鉴定有明确的指导价值。