实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果对比分析
2022-06-08
摘 要：目的 分析实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用效果。方法 选取2018年9月至2019年10月于我院就诊的360例腹泻患者为研究对象，采集所有患者的粪便标本并实施检测，同时进行实时荧光定量PCR法和常规细菌鉴定法检测，对比两种不同检测方法对肠道致病菌的检测阳性情况。结果 360份粪便标本中，常规细菌鉴定法检测出14株沙门菌，阳性率为3.89%,6株志贺菌，阳性率为1.67%；实时荧光定量PCR法检测出15株沙门菌经，阳性率为4.17%,6株志贺菌，阳性率为1.67%。两种检测方法对沙门菌及志贺菌的检测阳性率比较，组间差异无统计学意义（P> 0.05）。将实时荧光定量PCR法检测阳性患者的粪便标本再行常规细菌鉴定法检测，阳性率为100.00%。结论 作为能够将DNA直接从粪便标本中提取的方法，实施荧光定量PCR法可对肠道疾病患者致病菌予以准确检测，同时操作简便，能够缩短诊断时间。
关键词：腹泻 肠道致病菌 常规细菌鉴定法 实时荧光定量聚合酶链反应法 应用效果
临床中发病率较高的消化系统疾病之一即为腹泻，临床表现为排便次数增多且大便性状改变，可分为急性腹泻与慢性腹泻两种，急性腹泻的致病原因包括感染、中毒、药物及其他疾病，慢性腹泻致病原因则为肠道疾病（感染及非感染性）、肿瘤、小肠吸收障碍、肠动力异常、全身疾病及肝胆等组织器官疾病[1]。与其他类型腹泻相比，感染性腹泻的流行性较为广泛，主要致病菌包括沙门菌与志贺菌两类[2]。对感染性腹泻予以治疗前，首先需确定致病菌类型，才能准确用药，使治疗及预后效果得以提高。对腹泻致病菌予以检测的传统方法为常规细菌鉴定法，虽然有较高的检出率，但操作步骤繁琐及检验期较长，不具有灵敏度，同时易受外界其他因素的影响[3]。随着医疗技术的不断进步和发展，临床对于肠道致病菌的检测多应用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法，该方法对死细菌及活细菌均有较高的检出率，且操作简便。本文对实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用价值予以分析。报道如下。
选取我院2018年9月至2019年10月收治的360例腹泻患者为研究对象，并对以上患者的粪便标本予以采集。
1.2 方法
对所有患者粪便标本均实施常规细菌鉴定法及实时荧光定量PCR法检测。
常规细菌鉴定法：在肛拭子中应用采样器予以采取及增菌，采样器必须为一次性，增菌时长为18～24 h，增菌方法为于增菌液（志贺菌及沙门菌）中置入肛拭子。然后于XLD及SS琼脂中用划线法接种，并在37℃环境中培养样本于平板培养基中，对菌落变化进行观察及记录；其次需对可疑菌落进行选取，并实施涂片和染色处理，将其放置在显微镜下进行观看及检测；另对可疑菌落予以选取，在经涂片和染色处理后，实施氧化酶试验及触酶试验，若有必要，还可将血清学凝聚试验应用于以上标本中，确保妥善完成鉴定工作[4]。最后应用单价血清凝聚法及多价血清凝聚法判定取自于双糖内的细菌悬液。
实时荧光定量PCR法：实施3～5 h的增菌于肛拭子中，增菌液中需含有志贺菌及沙门菌，在1.5 m L无菌离心管中加入2滴增菌液，转移液体滴管需为一次性，然后再将20人份肛拭子增菌液加入以上试管中，进行3 min左右10 000 r/min转速的离心处理，将上清液予以最大限度移除，对50μL底层液进行检测。将DNA提取液共5μL加入底层液中并进行观察，直到沉淀悬浮现象出现后进行5 min左右100℃煮沸，再予以3 min10 000 r/min转速的离心，于干净灭菌离心管中置入离心所得5μL上清液[5]。使用25μL反应体系，将志贺菌VIC及沙门菌FAM作为检测通道，实施扩增后进行一个94℃/3 min循环检测，再进行40个93℃/30 s～55℃/45 s的循环检测。
1.3 统计学分析
将研究所得数据进行归纳整理，并将计数资料以[n（%）]的形式录入SPSS 25.0统计学软件中，组间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
常规细菌鉴定法为鉴定志贺菌及沙门菌的常用方法，检测环节包括3项，首先接种培养菌株，再行生化鉴定，最后对血清学予以检测，检测操作较为繁琐及检测试剂使用较多，因此检测用时相对较长，检测人员必须具有较高的检测技术及操作水平[10]。除此之外，常规细菌鉴定法的灵敏度不高，若受到以下因素影响，可能会降低检测的准确性：(1)因为该方法具有繁琐复杂的流程，在操作过程中若取菌环未降温，沾取的标本无较多菌落数量[11]；对志贺菌或沙门菌无法进行准确辨别，都有可能造成检测结果误差，提高漏诊及误诊发生率[12]。(2)若在实施检测之前，患者应用广谱抗菌类药物，那么则会使检测灵敏度降低。(3)若有干扰物质或杂菌存在于被检测样品中，则有可能降低检测成功率。除此之外，检测时间、样本数量以及培养条件等客观因素都会对细菌鉴定结果造成影响，再加上检测时间较长，致使该方法的应用效果较差。医疗技术及社会的不断进步使得分子生物学技术被广泛应用于医疗事业中，作为此类技术中用于鉴别肠道致病菌的方法，实时荧光定量PCR法可以弥补常规细菌鉴定法的缺陷，因为该方法检测的主要内容为细菌DNA，除可用于鉴别致病菌外，还能够对细菌性腹泻予以追踪。实时荧光定量PCR法虽然具有较高的灵敏度及检出率，但是需使用较为昂贵的试剂盒及离心管，为节约成本，可将上机样品设置为20人份，用于平摊检测费用，并且不会影响鉴定结果。
本次研究结果显示，360份粪便标本中，常规细菌鉴定法检测出沙门菌14株，志贺菌6株，检测阳性率分别为3.89%及1.67%；实时荧光定量PCR法检测出沙门菌15株，志贺菌6株，检测阳性率分别为4.17%及1.67%。两种检测方法对沙门菌及志贺菌的检测阳性率比较，组间差异无统计学意义（P>0.05）。将实时荧光定量PCR法检测阳性患者的粪便标本再行常规细菌鉴定法检测，阳性率为100.00%。
综上所述，在肠道致病菌的检测中，可应用实时荧光定量PCR法，该方法能够在提高检出率的同时，缩短检测时间。
参考文献
[1]陈华良.2种细菌鉴定法对微生物的检测及其药敏结果的影响[J].抗感染药学,2020,17(3):333-335.
[2]李秀华,张鹏,赖玉华.三种不同方式检测志贺杆菌的分析比较[J].黑龙江医药,2020,33(6):1388-1391.
[3]陈华伟,张文军,李德新.两种不同细菌鉴定法在临床血液检验中的应用分析[J].中国社区医师,2019,35(10):117-118.
[4]祝艳.两种细菌鉴定法在临床血液检验中的应用研究[J].中国继续医学教育,2019,11(30):68-69.
[5]高华增.直接细菌鉴定与药敏试验法在临床血液检验中的应用[J].中国继续医学教育,2019,11(9):38-40.
[6]朱渊,戴云山,王俊虎,等.基于聚合酶螺旋反应技术快速检测铜绿假单胞菌[J].微生物学通报,2019,46(5):1246-1256.
[7]赵琼.直接细菌鉴定法与常规药敏试验法在血液检验中的应用[J].糖尿病天地,2019,16(2):125.
[8]张明和,姜涛,燕彤,等.幽门螺杆菌四联根除治疗联合嗜酸乳杆菌对肠道菌群的影响[J].中华消化杂志,2020,40(12):837-842.
[9]段晓梅,李超男,耿福能,等.溃疡性结肠炎相关肠道菌群荧光定量PCR检测方法的建立[J].大理大学学报,2019,4(2):33-37.
[10]刘丹,王晓红,张小彬,等.脓毒症患者肠道菌群紊乱的临床研究[J].中华急诊医学杂志,2019,28(6):736-742.
[11]何玉姝,李慧玲,王瑾,等.肠道微生态变化与小儿反复呼吸道感染的相关研究[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2019,19(7):107-108.
[12]吴邹钰,马霄,苏艳丽,等.肠道菌谱分析在粪便细菌学检验中的应用及其临床价值[J].检验医学与临床,2019,16(24):3643-3645.
关键词：腹泻 肠道致病菌 常规细菌鉴定法 实时荧光定量聚合酶链反应法 应用效果
临床中发病率较高的消化系统疾病之一即为腹泻，临床表现为排便次数增多且大便性状改变，可分为急性腹泻与慢性腹泻两种，急性腹泻的致病原因包括感染、中毒、药物及其他疾病，慢性腹泻致病原因则为肠道疾病（感染及非感染性）、肿瘤、小肠吸收障碍、肠动力异常、全身疾病及肝胆等组织器官疾病[1]。与其他类型腹泻相比，感染性腹泻的流行性较为广泛，主要致病菌包括沙门菌与志贺菌两类[2]。对感染性腹泻予以治疗前，首先需确定致病菌类型，才能准确用药，使治疗及预后效果得以提高。对腹泻致病菌予以检测的传统方法为常规细菌鉴定法，虽然有较高的检出率，但操作步骤繁琐及检验期较长，不具有灵敏度，同时易受外界其他因素的影响[3]。随着医疗技术的不断进步和发展，临床对于肠道致病菌的检测多应用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法，该方法对死细菌及活细菌均有较高的检出率，且操作简便。本文对实时荧光定量PCR法与常规细菌鉴定法在肠道致病菌检测中的应用价值予以分析。报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料选取我院2018年9月至2019年10月收治的360例腹泻患者为研究对象，并对以上患者的粪便标本予以采集。
1.2 方法
对所有患者粪便标本均实施常规细菌鉴定法及实时荧光定量PCR法检测。
常规细菌鉴定法：在肛拭子中应用采样器予以采取及增菌，采样器必须为一次性，增菌时长为18～24 h，增菌方法为于增菌液（志贺菌及沙门菌）中置入肛拭子。然后于XLD及SS琼脂中用划线法接种，并在37℃环境中培养样本于平板培养基中，对菌落变化进行观察及记录；其次需对可疑菌落进行选取，并实施涂片和染色处理，将其放置在显微镜下进行观看及检测；另对可疑菌落予以选取，在经涂片和染色处理后，实施氧化酶试验及触酶试验，若有必要，还可将血清学凝聚试验应用于以上标本中，确保妥善完成鉴定工作[4]。最后应用单价血清凝聚法及多价血清凝聚法判定取自于双糖内的细菌悬液。
实时荧光定量PCR法：实施3～5 h的增菌于肛拭子中，增菌液中需含有志贺菌及沙门菌，在1.5 m L无菌离心管中加入2滴增菌液，转移液体滴管需为一次性，然后再将20人份肛拭子增菌液加入以上试管中，进行3 min左右10 000 r/min转速的离心处理，将上清液予以最大限度移除，对50μL底层液进行检测。将DNA提取液共5μL加入底层液中并进行观察，直到沉淀悬浮现象出现后进行5 min左右100℃煮沸，再予以3 min10 000 r/min转速的离心，于干净灭菌离心管中置入离心所得5μL上清液[5]。使用25μL反应体系，将志贺菌VIC及沙门菌FAM作为检测通道，实施扩增后进行一个94℃/3 min循环检测，再进行40个93℃/30 s～55℃/45 s的循环检测。
1.3 统计学分析
将研究所得数据进行归纳整理，并将计数资料以[n（%）]的形式录入SPSS 25.0统计学软件中，组间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
360份粪便标本中，常规细菌鉴定法检测出沙门菌14株，志贺菌6株，检测阳性率分别为3.89%及1.67%。实时荧光定量PCR法检测出沙门菌15株，志贺菌6株，检测阳性率分别为4.17%及1.67%。两种检测方法对沙门菌及志贺菌的检测阳性率比较，组间差异无统计学意义（P>0.05）。将实时荧光定量PCR法检测阳性患者的粪便标本再行常规细菌鉴定法检测，阳性率为100.00%。3 讨论
腹泻是一种常见且多发的疾病，可发生于任何年龄段的人群，患者临床表现为大便次数增多及大便稀溏等症状[6]。感染性腹泻的常见致病菌为志贺菌及沙门菌，传播途径包括消化道、饮用或进食受污染的水源或食品，使患者生活质量及身体健康受到不利影响[7-8]。对于感染性胃肠道疾病，临床通常给予抗生素治疗，考虑到抗生素应用的合理性，需在制订治疗方案前准确判断致病菌，并进行针对性给药，可以缩短治疗时间，改善患者症状及疾病预后效果[9]。常规细菌鉴定法为鉴定志贺菌及沙门菌的常用方法，检测环节包括3项，首先接种培养菌株，再行生化鉴定，最后对血清学予以检测，检测操作较为繁琐及检测试剂使用较多，因此检测用时相对较长，检测人员必须具有较高的检测技术及操作水平[10]。除此之外，常规细菌鉴定法的灵敏度不高，若受到以下因素影响，可能会降低检测的准确性：(1)因为该方法具有繁琐复杂的流程，在操作过程中若取菌环未降温，沾取的标本无较多菌落数量[11]；对志贺菌或沙门菌无法进行准确辨别，都有可能造成检测结果误差，提高漏诊及误诊发生率[12]。(2)若在实施检测之前，患者应用广谱抗菌类药物，那么则会使检测灵敏度降低。(3)若有干扰物质或杂菌存在于被检测样品中，则有可能降低检测成功率。除此之外，检测时间、样本数量以及培养条件等客观因素都会对细菌鉴定结果造成影响，再加上检测时间较长，致使该方法的应用效果较差。医疗技术及社会的不断进步使得分子生物学技术被广泛应用于医疗事业中，作为此类技术中用于鉴别肠道致病菌的方法，实时荧光定量PCR法可以弥补常规细菌鉴定法的缺陷，因为该方法检测的主要内容为细菌DNA，除可用于鉴别致病菌外，还能够对细菌性腹泻予以追踪。实时荧光定量PCR法虽然具有较高的灵敏度及检出率，但是需使用较为昂贵的试剂盒及离心管，为节约成本，可将上机样品设置为20人份，用于平摊检测费用，并且不会影响鉴定结果。
本次研究结果显示，360份粪便标本中，常规细菌鉴定法检测出沙门菌14株，志贺菌6株，检测阳性率分别为3.89%及1.67%；实时荧光定量PCR法检测出沙门菌15株，志贺菌6株，检测阳性率分别为4.17%及1.67%。两种检测方法对沙门菌及志贺菌的检测阳性率比较，组间差异无统计学意义（P>0.05）。将实时荧光定量PCR法检测阳性患者的粪便标本再行常规细菌鉴定法检测，阳性率为100.00%。
综上所述，在肠道致病菌的检测中，可应用实时荧光定量PCR法，该方法能够在提高检出率的同时，缩短检测时间。
参考文献
[1]陈华良.2种细菌鉴定法对微生物的检测及其药敏结果的影响[J].抗感染药学,2020,17(3):333-335.
[2]李秀华,张鹏,赖玉华.三种不同方式检测志贺杆菌的分析比较[J].黑龙江医药,2020,33(6):1388-1391.
[3]陈华伟,张文军,李德新.两种不同细菌鉴定法在临床血液检验中的应用分析[J].中国社区医师,2019,35(10):117-118.
[4]祝艳.两种细菌鉴定法在临床血液检验中的应用研究[J].中国继续医学教育,2019,11(30):68-69.
[5]高华增.直接细菌鉴定与药敏试验法在临床血液检验中的应用[J].中国继续医学教育,2019,11(9):38-40.
[6]朱渊,戴云山,王俊虎,等.基于聚合酶螺旋反应技术快速检测铜绿假单胞菌[J].微生物学通报,2019,46(5):1246-1256.
[7]赵琼.直接细菌鉴定法与常规药敏试验法在血液检验中的应用[J].糖尿病天地,2019,16(2):125.
[8]张明和,姜涛,燕彤,等.幽门螺杆菌四联根除治疗联合嗜酸乳杆菌对肠道菌群的影响[J].中华消化杂志,2020,40(12):837-842.
[9]段晓梅,李超男,耿福能,等.溃疡性结肠炎相关肠道菌群荧光定量PCR检测方法的建立[J].大理大学学报,2019,4(2):33-37.
[10]刘丹,王晓红,张小彬,等.脓毒症患者肠道菌群紊乱的临床研究[J].中华急诊医学杂志,2019,28(6):736-742.
[11]何玉姝,李慧玲,王瑾,等.肠道微生态变化与小儿反复呼吸道感染的相关研究[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2019,19(7):107-108.
[12]吴邹钰,马霄,苏艳丽,等.肠道菌谱分析在粪便细菌学检验中的应用及其临床价值[J].检验医学与临床,2019,16(24):3643-3645.