恶性疟原虫抗药性基因研究现状

　　摘  要：目前恶性疟原虫几乎对所有抗疟药物都产生了抗药性，研究与恶性疟原虫抗药性相关的恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因（Pfcrt）和恶性疟原虫多药抗药性基因（Pfmdr1）以及恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因（K13）突变有助于建立快速有效的疟原虫抗药性分子监测技术，对实现全球消除疟疾目标有着重要的意义。本文对恶性疟原虫药物抗性基因研究现状进行了综述。

　　关键词：恶性疟原虫 抗药性 恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因 恶性疟原虫多药抗药性基因 恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因

　　感染人类的疟原虫主要有4种：恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵型疟原虫。其中恶性疟原虫可引起重症疟疾，发病率和死亡率远高于其他疟疾。WHO统计，到2015年全球仍有91个国家和地区存在疟疾流行，新增疟疾感染病例约2.21亿，死亡病例约42.9万，主要为非洲地区的5岁以下儿童[1]。抗疟药在疟疾防治工作中起着重要作用，但抗疟药的长期使用致使疟原虫对药物产生了抗药性。在过去50年里，恶性疟原虫对氯喹、磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、奎宁、哌喹和甲氟喹等所有用于治疗疟疾的药物均产生了抗药性[2-6]。近年来恶性疟原虫对青蒿素[7]及其衍生物双氢青蒿素、蒿甲醚[8-9]和青蒿琥酯[10]等的抗药性和对青蒿素的联合治疗（ACTs）药物青蒿琥酯-甲氟喹[11]、蒿甲醚-苯芴醇[11]和青蒿素-哌喹[12]抗药性出现，正威胁着疟疾控制方面以往取得的所有重大成果。在抗疟药物的使用过程中疟原虫抗药性逐步发展，从最初仅在少数地区出现疟原虫清除延迟发展为疟疾发病率和地理范围不断升高和扩大，最终导致该抗疟药治疗彻底失败。近年来不少学者对恶性疟的抗药性做了大量研究，我们就恶性疟原虫抗药性基因研究现状作一综述。

　　1 恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因（Pfcrt）和恶性疟原虫多重抗药性基因（Pfmdr1)

　　Pfcrt和Pfmdr1基因突变是导致恶性疟原虫对氯喹抗药的主要原因。Pfcrt至少有4个突变点K76T、S72C、M74I和N75E与氯喹抗药有关，其中关键突变为K76T,4个突变点被多项研究证明与恶性疟原虫对氯喹产生抗药性程度有关[13]。近几年我国学者对上述基因的多态性进行了分析，周瑞敏等[14]对来自非洲19个国家输入的恶性疟原虫Pfcrt基因进行研究，结果发现Pfcrt基因存在3种类型：野生型（CVMNK）、突变型（CVIET）和混合型（CVM/I、N/E/D/K、T/K）。杨成运等[15]研究发现非洲输入性恶性疟原虫Pfmdr1基因发生突变。徐超等[16]研究结果显示来自非洲94例输入性恶性疟原虫的Pfcrt和Pfmdr1基因均有不同程度的突变，研究结果与对赤道几内亚恶性疟原虫Pfcrt基因的多态性分析结果一致[17]。国内的研究结果为我国输入性恶性疟疾的防治提供了一定的理论支持。OBOH等[18]检测发现尼日利亚西南部两个不同州恶性疟原虫的Pfcrt基因亦发生突变，这些突变使恶性疟原虫对氯喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶具有抗药性。在这两个种群中发现了许多独特的Pfcrt基因单倍型。此外检测到Pfcrt和其他基因（Pfdhfr）突变之间的强相关性，表明尼日利亚恶性疟原虫抗药基因的突变具有进化潜力。

　　ANTONY等[19]研究表明氯喹敏感型恶性疟原虫3D7株和氯喹抗药型Dd2株中Pfcrt基因表达水平没有差异，Pfcr蛋白编码序列无扩增。该研究以氯喹敏感型MRC2株表达蛋白为对照，在RKL9株细胞外提取蛋白中观察到12种蛋白质表达上调和14种蛋白质表达下调，同时在RKL9株细胞内提取蛋白中检测到40种蛋白质表达上调和22种蛋白质表达下调，提示除Pfcrt蛋白质外，其他蛋白质表达水平的差异变化也可能与恶性疟原虫氯喹抗性有关。

　　另一项在喀麦隆的研究表明Pfcrt的特定突变不仅与氯喹抗药有关，还与阿莫地喹抗药有关。阿莫地喹是喀麦隆用于治疗简单疟疾的ACTs之一。研究者提供了Pfcrt基因单核苷酸突变（SNP）多态性水平上的遗传变异数据，这些基因突变是发现于喀麦隆南部（疟疾最流行的地区）的5个不同地理环境中的疟原虫，这些地区是喀麦隆和其他两个非洲国家接壤的城市。研究者在Pfcrt基因中发现了两种迄今未见报道的新突变，并观察到不同人群的遗传多样性。在少数SNP之间发现高连锁不平衡，包括一个新的突变，表明联合用药会带来更高水平的抗药性。新的突变可能会在氯喹或阿莫地喹轮换使用而产生的抗药性中产生，这种变异可能是滥用氯喹或阿莫地喹施加的药物压力的结果[20]。

　　近年来多项研究表明Pfmdr1基因三联突变（S1034C/N1042D/D1246Y,CDY）可介导疟原虫对奎宁、甲氟喹、氯氟菲醇和青蒿素等的敏感性显着降低。Pfmdr1拷贝数（CNV）的增加与甲氟喹抗药有关，体外和体内研究证据表明Pfmdr1基因扩增在甲氟喹抗药的发生过程中起重要作用。而Pfmdr1基因扩增比Pfmdr1基因多态性更能预测甲氟喹的抗性。因此，推测甲氟喹抗药的机制可能是多种因素共同作用下的抗药表型的表达[21]。另外，报道显示在体外进行双氢青蒿素筛选恶性疟原虫也可导致CNV增加[22]。还有研究显示CNV与恶性疟原虫对氯喹的敏感性也相关[23]。

　　2 恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因（K13)

　　K13基因定位于恶性疟原虫第13号染色体，编码Kelch螺旋体蛋白（K13）。K13基因C580Y突变已被多次证实为青蒿素抗药性的分子标记。HASSETT等[23]对大湄公河次区域使用ACTs的情况、ACT效力逐渐丧失的情况以及K13突变的频率进行了分类，证实K13基因与ACTs抗药性有关。IMWONG等[24]利用收集自湄公河流域4个国家的恶性疟原虫分离株进行K13基因微卫星基因分型，结果显示青蒿素抗药型恶性疟原虫的优势谱系现在正在通过湄公河流域传播。

　　近年来ARIEY等[25]研究验证了K13基因5个突变点（M476I、Y493H、R539T、I543T、C580Y）都会引起恶性疟原虫对青蒿素敏感性的下降，证实K13多态性同样可以作为青蒿素抗药性的分子标记，与文献[26]的研究结果一致。在GHORBAL等[26]研究中发现不同的K13突变（上述5个突变点）可导致不同水平的青蒿素抗药性，而这些水平受到疟原虫遗传背景的影响。该研究还发现C580Y还使青蒿素对非洲疟原虫NF54产生了抗药性。BOULLE等[27]体外试验证实C580Y和N458Y突变体与寄生虫清除时间和疟原虫环状体存活率有关，这一研究表明N458Y也可作为青蒿素抗药性的分子标记，研究中还发现了4个可能与青蒿素抗药性有关的突变等位基因：E252Q、P441L、G538V和A675V。

　　恶性疟原虫抗药性分子机制的研究显示这两种转录表型都与K13多态性密切相关，并且可能通过修复和补充其氧化损伤的蛋白质，使疟原虫在细胞周期中得以生存。另一项研究还提出青蒿素以恶性疟原虫磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）为靶点，而P13K是K13的结合点，由于突变体K13不能结合P13K，从而产生青蒿素抗药性[28]。

　　科摩罗恶性疟原虫对青蒿素是否产生抗药性的研究显示，2006—2014年大科莫岛上恶性疟原虫种群的K13基因多样性有所增加。然而在检测的种群中没有发现与亚洲青蒿素抗药性相关的多态性。表明大科莫岛的恶性疟原虫种群仍然有效地易受青蒿素的影响。研究结果为了解恶性疟原虫种群中与青蒿素抗药性相关的基因突变提供了新思路，并将有助于在科摩罗制定和更新抗疟疾指南[29]。但也有研究表明非洲存在其他蛋白质介导的K13基因单核苷酸突变多态性（SNPs），揭示非洲存在青蒿素抗药性的其他可能[30]。

　　MIOTTO等[31]的研究不仅发现K13基因中SNP突变位点与青蒿素的抗药性有关，同时发现除这些突变点外，多抗药性Pfmdr2 T484I、Pfcrt N326S等突变可能同时参与介导氯喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶、甲氟喹和哌喹抗药性。董莹等[32]分析了云南、缅甸和非洲感染病例的Pfcrt基因和K13基因的联合突变特性，发现Pfcrt基因和K13基因联合突变率为27.1%，研究发现抗氯喹恶性疟原虫通过补偿性增殖放大其他抗性特征，且青蒿素抗性基因突变型之间可能存在种群扩张模式。在2007—2012年中缅边境多重抗药疟原虫监测研究中，收集了107个恶性疟原虫样本，测量了它们对10种抗疟药物的体外敏感性，发现尽管在恶性疟原虫治疗中停用了氯喹和抗叶酸盐，疟原虫对这些药物仍然具有很高的抗药性，并且Pfcrt、Pfdhfr和Pfdhps基因的突变非常普遍。而Pfmrp1基因几个突变与氯喹、哌喹、苯芴醇和双氢青蒿素一些药物的敏感性改变有关。而K13基因突变提示在多药抗药遗传背景下K13突变的潜在进化[33]。

　　3 结语

　　目前全球消除疟疾计划面临疟原虫抗药性的严重挑战。国内外学者对恶性疟原虫抗药性基因突变研究已经进行了广泛深入的探索。多年来的研究表明，Pfcrt基因突变及Pfmdr1基因突变多拷贝变异与氯喹、阿莫地喹及甲氟喹抗药性有关，恶性疟原虫对这些药物的抗药性与Pfcrt与Pfmdr1基因多态性也相关，而且Pfcrt与Pfmdr1基因多态性同时存在时，抗性水平更高。现今经研究证实K13基因是恶性疟青蒿素抗性的分子标志，该基因多个抗性位点与青蒿素抗性密切相关。

　　研究恶性疟原虫抗药性基因突变有助于建立快速有效的疟原虫抗药性分子监测技术，在越来越难以开展疗效研究的低传播地区尤为重要。及时监测疟原虫抗药性对减少疟疾发生，保护人类健康，实现全球消除疟疾目标有着重要的意义。

　　作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

　　参考文献

　　[1]WHO.World Malaria Report 2015[J].Working Papers,2015,30(82):189-206.

　　[2]WELLEMS TE,WALKER JA,PANTON LJ.Genetic mapping of the chloroquine-resistance locus on plasmodium falciparum chromosome 7[J].Proc Natl Acad sci USA,1991,88(8):3382-3386.

　　[3]MOCKENHAUPT FP.Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum[J].Parasitol Today,1995,11(7):248-253.

　　[4]杨恒林，刘德全，董莹，等.体外测定恶性疟原虫对七种抗疟药的敏感性[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1995,13(2):111-113.

　　[5]WARSAME M,HASSAN AM,HASSAN AH,et al.High therapeutic efficacy of artemether-lumefantrine and dihydroartemisinin-piperaquine for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Somalia[J].Malar J,2019,18(1):231.

　　[6]SPRING MD,LINJT,MANNING JE,et al.Dihydroartemisinin-piperaquine failure associated with a triple mutant including kelch13 C580Yin Cambodia:an observational cohort study[J].Lancet Infect Dis,2015,15(6):683-691.

　　[7]LU F,CULLETON R,ZHANG M,et al.Emergence of Indigenous Artemisinin-Resistant Plasmodium falciparum in Africa[J].N Eng1 J Med,2017,376(10):991-993.

　　[8]杨沧江.1例恶性疟对蒿甲醚抗性报道[J].实用寄生虫病杂志，2000,8(3):101.

　　[9]苏林光，王英，贾杰.抗蒿甲醚恶性疟2例[J].中国病原生物学杂志，2001,14(1):66.

　　[10]杨恒林，刘德全，黄开国，等.云南省恶性疟原虫对青蒿素类药物及咯萘啶与氯喹敏感性的体外测定[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997,15(5):292-296.

　　[11]WHO.Status report on artemisinin resistance:2014[R/OL].(2014)[2020-05-11].https：//www.who.int/malaria/publications/atoz/updateartemisinin-resistance-sep2014/en.

　　[12]TUN KM,JEEYAPANT A,IMWONG M,et al.Parasite clearance rates in Upper Myanmar indicate a distinctive artemisinin resistance phenotype:a therapeutic efficacy study[J].Malar J,2016,15(1):1-9.

　　[13]FIDOCK DA,NOMURA T,TALLEY AK,et al.Mutations in the P.falciparum digestive vacuole transmembrane protein Pfcrt and evidence for their role in chloroquine resistance[J].Mol Cell,2000,6(4):861-871.

　　[14]周瑞敏，轶楠，钱丹，等.2015年河南省输入性恶性疟原虫Pfcrt基因的多态性分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2016,34(5):399-404.

　　[15]杨成运，李素华，张雅兰，等.境外输入性恶性疟原虫药物抗性基因多态性分析[J].中国病原生物学杂志，2018,13(9):998-1001.

　　[16]徐超，魏庆宽，李瑾，等.境外输入性恶性疟原虫抗药性相关基因突变的检测[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2016,34(6):482-488.

　　[17]LI J,CHEN J,XIE D,et al.Molecular mutation profile of Pfcrt and Pfmdr1 in Plasmodium falciparum isolates from Bioko Island,Equatorial Guinea[J/OL].Infect Genet Evol,2015,36:552-556.[2020-05-09].https：//www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1567134815003627via%3Dihub.DOI:10.1016/j.meegid.2015.08.039.

　　[18]OBOH MA,SINGH US,ANTONY HA.Molecular epidemiology and evolution of drug-resistant ge nes in the malaria parasite Plasmodium falciparum in southwestern Nigeria[J/OL].Infect Genet Evol,2018,66:222-228.[2020-05-09].https：//linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1567-1348(18)30258-2.DOI:10.1016/j.meegid.2018.10.007.

　　[19]ANTONY H,PATHAK V,GHOSH K,et al.Comparison of protein expression pattern between the Plasmodium falciparum chloroquine-resistant RKL9 and chloroquine-sensitive MRC2 strains[J].Tropical Parasitol,2016,6(2):136-140.

　　[20]NGASSA M,DAS A.Analysis of genetic diversity in the chloroquineresistant gene Pfcrt in field Plasmodium falciparum isolates from five regions of the southern Cameroon[J/OL].Infect Genet Evol,2016,44:450-458.[2020-05-09].https：//linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1567-1348(16)30281-7.DOI:10.1016/j.meegid.2016.07.003.

　　[21]REAMTONG O,SRIMUANG K,SARALAmba N,et al.Protein profiling of mefloquine resistant Plasmodium falciparum using mass spectrometry-based proteomics[J/OL].Int J Mass Spectrom,2015,391:82-92.[2020-05-09].https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4708064.DOI:10.1016/j.ijms.2015.09.009.

　　[22]苏新专，李剑.青蒿素与疟疾：药物激活、作用机理及抗药性的研究进展[J].科学通报，2017,62(18):1928-1937.

　　[23]HASSETT MR,ROEPE PD.Origin and Spread of Evolving ArtemisininResistant Plasmodium falciparum Malarial Parasites in Southeast Asia[J].Am J Trop Med Hyg,2019,101(6):1204-1211.

　　[24]IMWONG M,SUWANNSIN K,KUNASOL C,et al.The spread of artemisinin-resista nt Plasmodium falciparum in the Greater Mekong subregion:a molecular epidemiology observational study[J].Lancet Infect Dis,2017,17(5):491-497.

　　[25]ARIEY F,MENARD D.An update on artemisinin resistance[J/OL].Methods Mol Biol,2019,2013:141-149.[2020-05-09].https：//dx.doi.org/10.1007/978-1-4939-9550-9_10.DOI:10.1007/978-1-4939-9550-9_10.

　　[26]GHORBAL M,GORMAN M,MACPHERSON CR,et al.Genome editing in the human malaria parasite plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system[J].Nat Biotechnol,2014,32(9):819-821.

　　[27]BOULLE M,WITKOWSKI B,DURU V,et al.Artemisinin-Resistant Plasmodium falciparum K13 Mutant Alleles,Thailand-Myanmar Border[J].Emerg Infect Dis,2016,22(8):1503-1505.

　　[28]FAIRHURST RM,DONDORP AM.Artemisinin-resistant?Plasmodium falciparum malaria[J/OL].Microbiol Spectr,2016,4(3).[202-05-11].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4992992/?report=classic.DOI:10.1128/microbiolspec.EI10-0013-2016.

　　[29]HUANG B,DENG C,YANG T,et al.Polymorphisms of the artemisinin resistant marker(K13) in Plasmodium falciparum parasite populations of Grande Comore Island 10 years after artemisinin combination therapy[J/OL].Parasit Vectors,2015,8:634.[2020-05-09].https：//parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-015-1253-z.DOI:10.1186/s13071-015-1253-z.

　　[30]MOHON A,MENARD D,ALAM M,et al.A novel single-nucleotide polymorphism loop mediated isothermal amplification assay for detection of artemisinin-resistant plasmodium falciparum malaria[J].Open Forum Infect Dis,2018,5(4).ofy011.

　　[31]MIOTTO O,AMATO R,ASHLEY EA,et al.Genetic architecture of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum[J].Nat Genet,2015,47(3):226-234.

　　[32]董莹，孙艾明，邓艳，等.云南省恶性疟原虫氯喹及青蒿素抗性相关基因的联合突变分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2017,35(3):202-208.

　　[33]GUSTAVO C,CERQUERIA IH,CHEESEMAN SF,et al.Longitudinal genomic surveillance of Plasmodium falciparum malaria parasites reveals complex genomic architecture of emerging artemisinin resistance[J].Genome Biol,2017,18(1):78.