HPLC 同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的浓度

［摘要］目的:建立能同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁浓度的HPLC分析方法。方法:大鼠血浆样品以石杉碱甲为内标，液液萃取法处理后用Kromasil C柱分离，以乙腈-0.01 mol·L－1庚烷磺酸钠与0.02 mol·L－1磷酸二氢钾等量混合后用10%磷酸调体系pH 2.8(24∶76)作流动相，检测波长264 nm。结果:血浆中杂质不干扰样品的含量测定，马钱子碱和士的宁在50～2 000μg·L－1线性良好，平均提取回收率均大于86%，日内、日间精密度均小于8%，稳定性符合体内药物分析要求。结论:方法灵敏度高、精密度好，可应用于马钱子总生物碱中主要成分的药物动力学研究。

　　［关键词］马钱子碱;士的宁;体内药物分析;高效液相色谱法

　　马钱子又名番木鳖，始载于《本草纲目·卷十八》，是马钱科植物马钱Strychnou nux-vomica L.的干燥成熟种子。总生物碱为其主要有效部位，其中又以士的宁(strychnine)和马钱子碱(brucine)含量为最高。目前，马钱子碱和士的宁的体内分析多以单独进行［1-4］，关于两者在生物样品中同时检测的报道尚不多见［5］。本研究以石杉碱甲(huperzine a)为内标，建立了HPLC同时测定马钱子碱和士的宁血药浓度的分析方法，研究马钱子总生物碱脂质体在大鼠体内的药动学。

　　1材料

　　1.1仪器日本岛津LC-10 A型高效液相色谱仪，包括SPD-10 A型紫外-可见检测仪，LC-10 A型高压恒流泵;上海安亭TGL-16 G型高速离心机;天津恒奥HSC-12 A型氮吹仪。

　　1.2试药马钱子(南京药业股份有限公司提供，经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定为马钱科植物马钱的干燥成熟种子);马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110706-200505);士的宁对照品(中国药品生物制品检定所，批号110705-200506);石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号100243-200601);庚烷磺酸钠(山东禹王实业有限公司);乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司);甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司);大豆磷脂(德国Lipoid公司，批号790549-1);胆固醇(分析纯，中国慧兴生化试剂有限公司);其他试剂均为分析纯。

　　酸水:0.01 mol·L－1庚烷磺酸钠与0.02 mol·L－1磷酸二氢钾等量混合后用10%磷酸调体系pH 2.8，再抽滤脱气即得。

　　1.3动物健康SD大鼠，雄性，体重200～230 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2007-0005。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件色谱柱Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相乙腈-酸水(24∶76)，流速1.0 mL·min－1，检测波长264 nm，进样量20μL，柱温35℃。

　　2.2血浆样品处理大鼠血浆样品加入40 mg·L－1石杉碱甲甲醇溶液20μL及1/5血浆体积的氨水，涡旋混合30 s。再加入5倍血浆体积的氯仿，涡旋混合3 min，超声20 min，室温下静置1 h，4 000 r·min－1离心10 min，收集下层清液。剩余物再以4倍血浆体积的氯仿重复以上液液萃取操作1次，合并萃取液后于50℃水浴下氮气流吹干。残渣用100μL甲醇复溶，12 000 r·min－1离心后进样。

　　2.3专属性考察空白大鼠血浆(不加内标)、马钱子碱和士的宁混合标准血样以及给药后的大鼠血样适量，按2.2项下处理后进样，色谱图见图1。结果表明，内标和待测物的峰形良好，分离完全，血浆中内源性杂质不干扰马钱子碱和士的宁的含量测定。

　　2.4线性范围和灵敏度空白大鼠血浆中加入适量马钱子碱和士的宁混合标准溶液(甲醇为溶剂)，混匀配制成相当于马钱子碱和士的宁浓度同为50，100，150，300，600，1 000，2 000μg·L－1的混合标准血样(500μL)，按2.2项下处理后进样。以浓度(C)为横坐标，以马钱子碱和士的宁对石杉碱甲的峰高比值(Y)为纵坐标，进行线性回归，马钱子碱Y=0.003 4 C－0.015 9，r=0.999 7;士的宁Y=0.003 7 C－0.023 2，r=0.999 4。两者在50～2 000μg·L－1线性良好。按S/N=3求算马钱子碱和士的宁的最低检测限分别为11.25，10.71μg·L－1;按S/N=10求算两者的定量限则分别为:37.50，35.71μg·L－1。

　　2.5回收率与精密度试验低、中、高(50，300，2000μg·L－1)浓度的混合标准血样，按2.2项下处理后进样，计算日内及日间精密度。以同浓度下马钱子碱和士的宁对石杉碱甲的峰高比值除以混合标准溶液直接进样所得的峰高与内标峰高的比值计算提取回收率，以实测浓度除以理论浓度计算方法回收率。见表1。

　　2.6稳定性试验中浓度的混合标准血样4份，－20℃冻存，分别于0，5，10，15 d取出解冻，并按2.2项下处理后进样，测得马钱子碱RSD 7.10%，士的宁RSD 1.47%。另配制中浓度的混合标准血样4份，按2.2项下处理所得残渣均用100μL甲醇复溶，高速离心后室温放置，并分别于0，4，8，12 h进样，测得两者RSD分别为5.68%，5.57%。表明样品在该实验条件下稳定性良好。

　　2.7药物动力学研究

　　2.7.1马钱子总生物碱脂质体的制备与含量测定按文献［6］方法进行马钱子总生物碱的提取纯化及其脂质体(大豆磷脂为膜材)的制备，凝胶柱层析法［7］除去未包封的总生物碱后，HPLC［6］测定脂质体中马钱子碱和士的宁所占比例分别为(26.01±3.24)%，(44.43±6.07)%(n=5)。

　　2.7.2药物动力学试验取大鼠6只，实验前禁食12 h，不禁水，尾静脉注射2.0 mg·kg－1的马钱子总生物碱脂质体，折算成马钱子碱和士的宁的剂量分别为(0.52±0.06)，(0.89±0.12)mg·kg－1。于给药前和给药后5，10，15，20，30，40，60，90，120 min眼球后静脉丛取血，置肝素化离心管中，4 000 r·min－1离心10 min，分取血浆，－20℃保存，解冻后按2.2项下处理并测定其中马钱子碱和士的宁的浓度，绘制血药浓度-时间曲线见图2。

　　将所得数据用3 P97药物动力学程序处理，结果表明，大鼠尾静脉注射马钱子总生物碱脂质体后，其主要成分马钱子碱和士的宁的体内过程均符合三室模型，统计矩方法计算所得相关药物动力学参数见表2。

　　以上结果表明:马钱子总生物碱脂质体静脉注射给药后，其主要成分的药物动力学参数均比较接近(AUC除外)，提示这2种结构基本相同的生物碱(马钱子碱仅比士的宁多2个甲氧基)在体内具有相似的药物动力学特征。

　　3讨论

　　本研究参照2005年版《中国药典》的色谱条件，但检测波长选为264 nm，主要是考虑到马钱子总生物碱中含量相对较低的马钱子碱在264 nm处有最

　　大吸收。另外，通过对流动相中的有机相比例的考察，发现随乙腈比例的增加，出峰时间提前。当乙腈比例调整为24%时，马钱子碱与士的宁分离良好，

　　峰形改善。同时，血浆中内源性杂质不干扰样品的含量测定。

　　马钱子碱与士的宁均为碱性药物宜在碱性环境下用有机溶剂提取。故本研究采用氨水碱化血，样并测得当氨水用量为血浆体积量的1/5时溶液体系的pH约为14。在此条件下，马钱子碱与士的宁主要以游离分子形式存在，在有机相中的分配增加，从而提高了提取效率。

　　本研究选择氯仿作为提取溶剂，所得血浆样品的色谱图中内源性杂峰干扰少。同时，其对于石杉碱甲的提取回收率高达(84.63±8.45)%(n=5)。

　　本研究采用内标法，并以峰高比进行定量，在消除血浆内源性杂质对实验结果造成干扰的同时，还可以减轻因药物在提取过程中损失对实验结果造成的影响，使测定结果准确，并呈现良好的重现性，适合用于马钱子总生物碱中主要成分的药物动力学研究。

　　［参考文献］

　　［1］高颖，陈军，蔡宝昌，等.HPLC法测定大鼠血浆中马钱子碱的浓度［J］.药物分析杂志，2008，28(12):2036.

　　［2］张婷，陈军，王玮，等.马钱子碱脂质体在大鼠体内的药物动力学研究［J］.中华中医药学刊，2010，28(1):69.

　　［3］邹龙，桂卉，黄世超，等.不同粒径马钱子粉体中士的宁在大鼠体内的药物动力学研究［J］.中华中医药杂志，2009，24(12):1568.

　　［4］王春英，范丽芳，王伟，等.RP-HPLC法测定生物体内士的宁的浓度［J］.河北医科大学学报，2007，28(1):28.

　　［5］王朝虹，果德安，胡春华.反相高效液相色谱法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量［J］.色谱，2003，21(4):382.

　　［6］杨希雄，陈军，胡君寅，等.高效液相色谱法同时测定马钱子总生物碱脂质体中士的宁和马钱子碱的含量［J］.中国医院药学杂志，2008，28(19):1641.

　　［7］陈军，蔡宝昌，胡敏敏，等.马钱子碱脂质体包封率测定方法的考察［J］.南京中医药大学学报，2007，23(6):371.