一株高产壳聚糖酶细菌的筛选及发酵条件优化

摘要：壳聚糖（Chitosan）及其降解产物因具有优良的物理特性和生物活性而被广泛关注。研究通过平板透明圈初筛、摇瓶复筛方法，从青岛海岸土壤中分离筛选到1株产壳聚糖酶活性较高的细菌K1，并对其产酶发酵条件进行了单因子优化试验。结果表明，经16S rDNA序列分析，K1菌株被鉴定为Mitsuaria sp. K1（GenBank登录号：KC489157）；最适产酶发酵条件为1.0%（m/V，下同）粉末壳聚糖，0.5%硝酸钾，0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，碳源∶氮源=2∶1，培养基初始pH 6.5，接种量3.0%（V/V），摇瓶装液量100 mL，培养温度25 ℃，培养时间24 h。在最适条件下，K1菌株发酵液中壳聚糖酶活最高可达到11.50 U/mL，是优化前酶活的5.3倍，且发酵温度较低，产酶周期较短，具有较高的工业发酵应用价值。

　　关键词：壳聚糖酶；细菌；筛选；发酵条件；优化

　　中图分类号：TQ920.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0517-05

　　壳聚糖[（1，4）-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖]，是天然多糖中为数不多的含阳离子高分子聚合物[1]。因其具有高生物相容性、易成膜性、安全性、生物降解性等特征而被各行业高度重视[2]。壳聚糖的进一步降解产物为一系列具有生物活性功能的低分子壳寡糖和氨基葡萄糖，具有抗菌、调节机体免疫、抗肿瘤及促进农作物增产等功效，故在食品、医药等领域中具有广阔的应用前景[3]。壳聚糖来自于其前体物质甲壳质[（1，4）-2-乙酰氨基-2-β-脱氧-D-葡萄糖，脱乙酰后成为壳聚糖]，在自然界中分布极为广泛（存在于各类节肢动物、软体动物、环节动物和某些真菌中）[4]，是地球上数量仅次于纤维素的含氮有机化合物。

　　目前，降解壳聚糖的方法有化学法、物理法、酶解法、电化学法等[5]，其中酶解法主要是利用微生物产酶来制备壳寡糖。因该法具有特异性强、节能、环保、安全等优势而成为国际研究热点。

　　自然界存在很多微生物能够产生降解甲壳质和壳聚糖的酶，然而它们的产酶能力却受物种、培养条件等多种内外因素的影响[6]。因此分离筛选高效产酶微生物并对其产酶条件进行研究是酶解法降解壳聚糖的基础。本研究通过平板透明圈初筛、液体发酵复筛等方法，从青岛沿海岸边虾壳、贝壳堆积土壤和生物工程公司排污口土壤中分离筛选到一株产活性较高壳聚糖酶的细菌，通过单因子试验对该菌的产酶发酵条件进行了前期探索，并对其分类地位进行了初步的鉴定，将为后续该菌株在工业发酵上的应用打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌种来源

　　土壤样品采集自青岛沿海岸边虾壳、贝壳堆积土壤和某生物工程公司排污口处土壤。样品采集后保存于4 ℃冰箱备用。

　　1.2 菌株平板透明圈初筛

　　称取0.5 g土样于无菌水中，振荡摇匀静置6 h后悬液做梯度稀释，然后涂布于初筛平板上（培养基A液：胶体壳聚糖1.0 g，去离子水100 mL，pH 6.2；B液：KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.1 g，KCl 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2 0.002 g，KNO3 0.5 g，葡萄糖0.1 g，酵母膏0.1 g，琼脂3 g，去离子水100 mL，pH 6.0；A液、B液分别于115 ℃灭菌30 min后，按体积比1∶1混合均匀倒平板），30 ℃培养3～5 d。挑取产透明圈的菌株，再接入新制初筛平板上划线分离单菌落。挑取生长良好、透明圈明显的单菌落，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），选取二者比值（D/d）较大者保存斜面备用。

　　胶体壳聚糖的制备方法参考文献[7]：将6 g壳聚糖粉末和400 mL 0.2 mol/L的HCl加入均质机中，搅拌1 min至完全溶解，期间缓慢滴加2 mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，使壳聚糖完全以白色乳状胶体析出。将壳聚糖胶体于5 000 r/min 离心沉淀15 min，去上清液，用去离子水反复冲洗沉淀至上清液pH呈中性。然后在均质机搅拌下用0.2 mol/L的HCl溶液调pH至6.2，使壳聚糖完全溶解，补足去离子水至总体积为600 mL，115 ℃灭菌30 min，4 ℃冰箱保存备用。

　　1.3 菌株摇瓶发酵复筛

　　将活化好的初筛菌株斜面接入LB液体培养基中30 ℃扩大培养，然后再以5%（V/V，下同）的接种量接入发酵培养基（配方：粉末壳聚糖1.0 g，KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.1 g，KCl 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2 0.002 g，KNO3 0.5 g，去离子水100 mL，pH 6.0）中，30 ℃、160 r/min进行产酶发酵培养。每天取发酵培养液2 mL经10 000 r/min离心10 min后取上清液测定酶活性，并选择保留高酶活菌株。

　　1.4 发酵液壳聚糖酶活性的测定

　　参照Imoto等[8]的方法并略作改动。取发酵液2 mL，10 000 r/min离心10 min，取100 μL上清液加入到装有0.9 mL 1%胶体壳聚糖和1 mL pH 5.6的醋酸缓冲液试管中（提前50 ℃保温2 min），50 ℃精确保温15 min，加入1.5 mL DNS终止反应，沸水浴5 min显色，冰水冷却至室温后用去离子水定容至25 mL，振荡摇匀，6 000 r/min离心10 min，取上清液测520 nm下的OD值。对照组酶液先煮沸灭活，之后按照上述方法同样处理。根据氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线折算成还原糖量，进而推算出酶活。1个酶活性单位定义为在50 ℃下每分钟产生相当于1 μmol氨基葡萄糖盐酸盐的还原糖所需要的酶量。

　　1.5 菌株的16S rDNA 序列测定与分析

　　选取上述筛选的高壳聚糖酶活性菌株，采用冻融法破裂菌体细胞， DNA提取试剂盒（康为世纪公司生产）提取总DNA。利用通用引物（27F： 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′， 1492R：5′- GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）进行菌株16S rDNA的PCR扩增。50 μL PCR反应体系包含PCR mastermix 25 μL， 正向引物27F 0.5 μL，反向引物1492R 0.5 μL，DNA模板5 μL， 去离子水 19 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序结果在GenBank中进行序列比较，应用 MEGA 5.1软件进行同源性分析并构建系统发育树（Neighbor-joining方法）。

　　1.6 菌株产酶发酵条件的单因子试验

　　1.6.1 不同碳源对发酵产酶的影响 分别以1.0%（m/V，下同）胶体壳聚糖、1.0%粉末壳聚糖、1.0%胶体壳聚糖+0.1%葡萄糖、1.0%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖、1.0%葡萄糖、1.0%淀粉、1.0%蔗糖为碳源进行发酵培养（160 r/min，30 ℃），然后测定发酵上清液酶活。

　　1.6.2 碳源添加量对发酵产酶的影响 分别以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%粉末壳聚糖为碳源进行发酵培养（160 r/min，30 ℃），然后测定发酵上清液酶活。

　　1.6.3 不同氮源对发酵产酶的影响 在发酵培养基中，以1.0%粉末壳聚糖为碳源，分别以0.5%硫酸铵、0.5%硝酸铵、0.5%氯化铵、0.5%尿素、0.5%硝酸钾、0.5%酵母粉、0.5%蛋白胨为氮源进行发酵培养（160 r/min，30 ℃），然后测定发酵上清液酶活。

　　1.6.4 氮源不同添加量对发酵产酶的影响 在发酵培养基中，以1.0%粉末壳聚糖为碳源，分别以0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的硝酸钾为氮源进行发酵培养（160 r/min，30 ℃），然后测定发酵上清液酶活。

　　1.6.5 培养时间对发酵产酶的影响 将种子菌液以5%接种量接入发酵培养基，置于160 r/min、30 ℃摇床振荡培养，分别于8、16、24、36、48、72、96、120 h取发酵上清液测定酶活。

　　1.6.6 培养温度对发酵产酶的影响 将种子菌液以5%接种量接入发酵培养基，设定摇床转速160 r/min，分别在15、20、25、30、35、40 ℃条件下发酵培养24 h，取发酵上清液测定酶活。

　　1.6.7 培养基初始pH对发酵产酶的影响 将发酵培养基的pH分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接入种子菌液后，于160 r/min、25 ℃摇床发酵培养24 h，取上清液测定酶活。

　　1.6.8 接种量对发酵产酶的影响 将种子菌液分别以1%、2%、3%、5%、7%、9%接种量接入发酵培养基，调初始pH 6.5，160 r/min、25 ℃下发酵培养24 h，取上清液测定酶活。

　　1.6.9 摇瓶装液量对发酵产酶的影响 在500 mL三角瓶中，分别装入50、100、150、200、250 mL的培养基，调pH 6.5，以3%接种量接入种子菌液，160 r/min、25 ℃下发酵培养24 h，取上清液测定酶活。

　　2 结果与分析

　　2.1 初筛与复筛结果

　　以胶体壳聚糖为惟一碳源，利用平板透明圈初筛与液体摇瓶复筛，从采集的土样中筛选出3株细菌菌株（编号为K1、K5、T1）和3株真菌菌株（编号为K7、W1、T2），其透明圈直径与菌落直径比值、最高酶活见表1。由表1可知，3株细菌菌株K1、K5、T1的D/d比值和最高酶活均明显高于3株真菌菌株K7、W1、T2，其中以细菌菌株K1的液体发酵酶活最高（2.17 U/mL）。但各菌株酶活与D/d比值不成正比，这可能是由于菌株自身生理活性、所产壳聚糖酶种类及作用在两种检测方法中的效果差异所致，说明平板D/d比值只可作为菌株产酶的初步判断标准，而液体发酵酶活才是菌株产酶比较真实的反映。

　　2.2 筛选菌株的16S rDNA 系统发育鉴定结果

　　选取产酶活性最高的细菌菌株K1进行了16S rDNA 序列测定（全长1 414 bp，GenBank登录号：KC489157）和系统发育分析。从系统进化树（图1）中可以看到，在与K1相关的8个模式菌株当中（与K1相比序列相似性均大于97%），K1菌株与Mitsuaria chitosanitabida 3001T的序列相似性最高（为99.15%）。因此初步判定K1菌株为Mitsuaria sp.，下列试验均以Mitsuaria sp. K1菌株作为目标菌。

　　2.3 K1菌株产酶发酵条件优化结果

　　2.3.1 不同碳源及最佳碳源质量体积比对产酶的影响 不同碳源对微生物的生长代谢影响很大。不同类型碳源及最佳碳源质量体积比对K1菌株产酶的影响见图2。从图2A可知，本试验所采用的胶体壳聚糖、粉末壳聚糖作为碳源比较适合K1菌株产酶，而利用葡萄糖、淀粉、蔗糖作为碳源的产酶能力非常弱，说明该菌所产的酶为诱导酶。另外，胶体壳聚糖加少许葡萄糖与单独利用粉末壳聚糖的产酶效果相当（相对酶活大于94.2%），但是考虑到胶体壳聚糖制作工艺繁琐、成本高、重复性差，因此本试验将粉末壳聚糖确定为最佳碳源。由图2B可知，随着粉末壳聚糖质量体积比的增大，K1菌株产酶能力逐渐增强；但当粉末壳聚糖质量体积比超过2.0%时酶活却开始下降。这可能是由于随着碳源质量体积比的增大导致发酵液黏稠度增加，从而影响了溶氧量及菌株代谢产酶。另外，粉末壳聚糖质量体积比为1.0%和1.5%时的相对酶活分别为98.0%和99.5%，因此从成本考虑，本试验选择1.0%粉末壳聚糖作为最佳碳源。

　　2.3.2 不同氮源及最佳氮源添加量对产酶的影响 不同氮源及最佳氮源添加量对K1菌株产酶的影响见图3。由图3A可知，在1.0%碳源和0.5%氮源用量水平上，不同类型的氮源对K1菌株产酶效果影响很大，其中无机氮源的利用效果要远好于有机氮源。而在几种无机氮源中，又以硝酸钾的效果最佳，因此本试验选择硝酸钾为最佳氮源。从图3B可以看出，最佳氮源添加量对K1菌株的产酶影响十分明显。在1.0%碳源水平上，应用0.5%氮源时菌株所产酶活性最高，氮源用量过大、过小均明显影响菌株所产酶活性。因此确定2∶1为最适碳氮比。

　　2.3.3 培养时间、培养温度、培养基初始pH对产酶的影响 由图4A可知，在最适碳氮源条件下，K1菌株液体发酵24 h时的相对酶活达到最大值，发酵48 h的相对酶活仍能达到90.8%，但随着发酵时间延长至120 h时，相对酶活下降至37.3%。发酵酶活随时间变化趋势与该菌株的生长曲线基本保持一致，即酶活最大值与生长曲线最高峰几乎在同一时间出现。因此选择24 h为该菌株的最佳发酵时间。培养温度和培养基初始pH对发酵的影响是多方面且错综复杂的，主要表现在对微生物生长繁殖、产物合成积累以及发酵液物理性质等方面的影响。从图4B、图4C可以看到，25 ℃左右是K1菌株比较适合产酶的培养温度，而培养基的初始pH在6.5左右最合适。因此，选择25 ℃和pH 6.5作为该菌株的最适培养温度和最适培养基初始pH。

　　2.3.4 接种量和摇瓶装液量对产酶的影响 在最适碳氮源、培养时间、培养温度、培养基初始pH条件下，对K1菌株的接种量和摇瓶的装液量进行了探索。因为菌种接种量和摇瓶装液量也是影响微生物发酵产酶的重要因素之一。从图5A、图5B可以看到，接种量为3%、500 mL三角瓶装液量为100 mL时的相对酶活均能达到最高值。接种量过大虽能缩短发酵周期，但会引起初级代谢过度，过多产生代谢废物；接种量过小则会延长发酵时间，降低生产效率；摇瓶装液量过大会影响发酵液的溶氧量，过小则会使发酵液蒸发变浓。

　　3 小结与讨论

　　通过平板透明圈初筛、液体发酵复筛试验，获得一株产活性较高壳聚糖酶的细菌菌株K1（16S rDNA系统发育鉴定为Mitsuaria sp.）。对该菌株进行的一系列单因子发酵条件优化试验结果显示，其在最适培养条件下（1.0%粉末壳聚糖、0.5%硝酸钾、0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，培养基初始pH 6.5、培养温度25 ℃、3%接种量、100 mL装液量、培养时间24 h、160 r/min摇床转速）的最高酶活达11.50 U/mL，是优化前酶活2.17 U/mL的5.3倍。目前，国内外学者在筛选产壳聚糖酶菌株及其发酵条件优化方面已做了许多工作，但其所获菌株的发酵液酶活及发酵周期却差异较大。从发酵液酶活看，大多数菌株所产酶活性在10 U/mL以下[9-12]，少数在10～100 U/mL之间[13-16]，个别在100 U/mL以上[17-19]；从培养温度和发酵周期看，绝大部分菌株在30～40 ℃、48～72 h之间；尽管黄磊等[20]筛选的P1菌株和贾艳萍等[21]筛选的C001菌株能在较短时间内（分别为12 h和18 h）达到最高酶活，但发酵液酶活却比较低（在10 U/mL以下）。与已有报道相比，K1菌株所产酶活性属中等偏上水平，但发酵温度较低，产酶周期能缩短50%左右，因此具有工业发酵应用价值。如对其进一步进行适当诱变处理，相信产酶能力还会有较大的提升空间。

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