越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性研究

摘要：研究越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418产生的杀线虫活性代谢产物，采用根结线虫（Meloidogyne spp.）2龄幼虫生物测定法对B418发酵液上清液的热稳定性、酸碱稳定性及有机溶剂的稳定性进行了研究。结果表明，B418代谢产物的处理温度最高不应超过60 ℃；pH稳定范围为7.0～10.0，其中pH为7.0时B418代谢产物活性最高，B418代谢产物处理后8 h试虫最高校正致死率为76.63%；以乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正丁醇均降低了B418代谢产物的杀线虫活性，氯仿不影响代谢产物活性，氯仿处理后的代谢产物线虫死亡率稳定在74%以上。

　　关键词：越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418；代谢产物；杀线虫活性；稳定性

　　中图分类号：TQ453.5；S432.4+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1066-03

　　植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，其危害超过细菌和病毒，仅次于致病真菌 [1，2]。据估计，全球每年由植物寄生线虫造成的损失达1 250亿美元[2]，这一损失的70%是由根结线虫（Meloidogyne spp.）引起[3]。根结线虫寄主范围广，可危害多种常见蔬菜，且以种植面积较大的番茄、黄瓜、芹菜等受害较重，已成为蔬菜生产中的严重问题之一[4]。

　　保护地蔬菜根结线虫的治理非常困难，在实际生产中，传统的耕作措施，如轮作、种植抗病品种、施用农家肥、日晒等往往难以奏效。长期大量施用化学杀线虫剂防治根结线虫，会导致农产品农药残留超标和环境污染，破坏生态平衡[5]。生物防治因具有除害增产、保护生态平衡、减轻环境污染等优势[6]，越来越受到人们的关注。

　　多功能生防菌越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418由山东省科学院生物中心农业微生物研究室保存，该菌分离自白俄罗斯大麦根际土壤，能够有效防治根结线虫病。田间试验表明[7，8]，B418对番茄根结线虫病的防治效果为63.42%，对茄子根结线虫的防治效果为75.60%。室内毒力测定结果显示， B418发酵液上清液处理2龄根结线虫6 h后校正死亡率达70%以上，可见，B418代谢产物含有杀线虫活性物质。本研究对越南伯克霍尔德氏菌B418发酵液上清液的热稳定性、酸碱稳定性及有机溶剂的稳定性进行了检测，旨在为其杀线虫活性物质的分离纯化奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　越南伯克霍尔德氏菌B418、南方根结线虫（Meloidogyne incongnita），由山东省科学院生物中心农业微生物研究室保存；乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和盐酸均为市售分析纯。

　　B418 固体培养基每升含 K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.02 g、CaCl2 0.2 g、NaMoO4·2H2O 0.002 g、乙二胺四乙酸铁钠盐0.066 g、谷氨酸钠0.05 g、葡萄糖5 g、琼脂15 g，pH 7.2～7.4；B418 液体培养基每升含蛋白胨10 g、酵母浸出物1 g、CaCl2 0.2 g，pH 7.2～7.4。

　　1.2 方法

　　1.2.1 生物测定方法

　　1）根结线虫2龄幼虫的获得。根结线虫用室内盆栽番茄（中蔬4号）保存。当番茄根系有大量卵囊出现时，取出根系，用自来水轻轻冲洗，小心取下卵囊，0.5% 次氯酸钠中浸泡3 min，无菌水冲洗3次，放在盛有少量无菌水的培养皿里，25 ℃恒温箱中培养4 d，每隔24 h收集1次2龄幼虫。

　　2）B418发酵上清液活性测定。B418发酵上清液（原液）加入24孔培养板中，每孔加入0.1 mL，5次重复，并设无菌水作对照（CK）。分别向各孔中加入根结线虫2龄幼虫，每孔50条左右。放入25 ℃培养箱中，观察记录线虫死亡情况，计算（校正）死亡率。

　　1.2.2 B418杀线虫活性产物的稳定性测定

　　1）不同温度及酸碱度下的稳定性。取B418发酵上清液5倍稀释后分别在常温、60、80、100 ℃ 水浴锅中处理60 min，-20 ℃处理12 h，115 ℃ 处理30 min，测定处理后的B418发酵上清液的杀线虫活性，以6 h校正死亡率来体现。用1 mol /L NaOH 和1 mol /L HCl 将pH 分别调至2.0、3.0、4.0、5. 0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，静置12 h 后将pH 调到7. 0，取原液和处理后的发酵上清液分别5倍稀释后测定杀线虫活性，以8 h校正死亡率来体现。

　　2）不同有机溶剂下的稳定性。取B418发酵上清液，分别加入等体积乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿和乙酸乙酯，原液混合摇匀静置12 h，如分层则将上下层各取400 μL、不分层的取800 μL，另取原液400 μL滴加到滤纸片上，60 ℃ 烘干，加入与滴加量等体积的无菌水浸泡滤纸片2 h，取浸泡液和原液测定。

　　2 结果与分析

　　2.1 B418代谢产物的热稳定性测定

　　B418代谢产物的热稳定性测定结果见表1。由表1可知， 经60 、80、100、115 ℃热处理后，B418发酵上清液的杀线虫活性随处理温度的升高而下降。表明活性物质的处理温度最高不应超过60 ℃。

　　2.2 B418代谢产物的酸碱稳定性

　　B418代谢产物酸碱稳定性测定结果见表2。由表2可知，B418代谢产物的杀线虫活性稳定的pH范围为7.0～10.0。其中，pH为7.0时活性最强，线虫校正死亡率最高为76.63%。表明B418杀线虫活性产物能耐pH 10.0以下的碱性环境。

　　2.3 B418代谢产物的有机溶剂稳定性

　　B418代谢产物的有机溶剂稳定性检测结果见表3。由表3可知，B418代谢产物经有机溶剂处理后，除氯仿和乙醚处理外，杀线虫活性均有较大程度降低，其中乙酸乙酯处理活性降低最多，其上依次为石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿处理原液、原液、60 ℃烘干原液杀线虫活性相当。表明氯仿处理对B418代谢产物的杀线虫活性影响不大。

　　3 小结与讨论

　　越南伯克霍尔德氏菌B418是多功能生防菌株，具有解磷、解钾、固氮、促生及防治根结线虫病的作用。但B418菌株作为活菌制剂直接施于田间防治根结线虫病时，其定殖受环境（如土壤有机质、水分、pH、温度、微生物区系）的影响[9，10]，制约着B418菌株的使用效果。因此，本试验对越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性进行了研究，旨在为杀线虫活性物质的分离纯化奠定基础，为新的生物农药开发提供理论依据。

　　通过对B418菌株发酵上清液稳定性测定，表明活性物质的处理温度最高不应超过60 ℃。代谢产物杀线虫活性稳定的pH范围为7.0～10.0，pH为7.0时活性最高，8 h最高校正死亡率为76.63%。另外，在测定B418代谢产物生长曲线及pH变化中发现，初始pH为7.4时，接菌后前6 h发酵上清液的pH下降，但在7.0以上；6 h后pH持续上升，6 d时pH达到9.3。由此可知，在分离纯化B418代谢产物时，可不考虑其发酵上清液pH的影响。B418代谢产物的有机溶剂稳定性测定结果表明，氯仿处理不影响活性成分的杀线虫作用；乙醚处理杀线虫活性虽然最高，因其有易挥发特性，可能存在溶剂相减少，样品浓缩的可能，故试验结果有待进一步证实。

　　参考文献

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　　[9] 张炳欣，张 平，陈晓斌.影响引入微生物根部定殖的因素[J].应用生态学报，2000，11（6）：951-953.

　　[10] 年洪娟，陈丽梅.土壤有益细菌在植物根际竞争定殖的影响因素[J].生态学杂志，2010，29（6）：1235-1239.