食品中大肠杆菌之检测研究

　　摘要：大肠杆菌广泛存在于日常环境中（土壤、水质、食品），是食品及饮用水是否遭受粪便污染之生物指标，大肠杆菌为兼性厌氧性的革兰氏阴性杆菌，大部份大肠杆菌是无害且生长在健康人的肠道中，某些大肠杆菌可提供人体所需的维生素 B12 和维生素 K，亦能抑制其它病原菌之生长 ； 由于该菌一般栖息在人和动物的肠道中，故可视为食品是否曾受粪便污染的指标。 

　　关键词：食品 大肠杆菌 检测 研究 

　　一、前言 

　　食品遭大肠杆菌污染可能是由于加工不适、设备清洗不完全、生熟食交叉污染或储存不当而受粪便污染，故大肠杆菌及大肠杆菌群之检验，正足以呈现出食品原料、半成品、食品本身及其于制造过程之基本卫生现况 ；此外包含其他肠内菌如果饮用水、饮料和食品中发现有大肠杆菌，表示已受污染。 

　　二、大肠杆菌特性描述 

　　大肠杆菌其属名埃希氏菌为人体和动物肠道的正常菌种，短杆状、具有鞭毛、可运动，不会形成芽胞。发表文章大肠杆菌群还包括肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷柏氏杆菌属等。系指一群好气及兼性厌氧的革兰氏阴性菌，生长温度范围为-2℃～ 50℃，最适合生长的温度为37℃，生长pH值介于4.4至9.0之间，为兼性厌氧之格兰氏阴性菌，技术上大肠杆菌群被定义为所有好氧或兼性好氧，不形成孢子，革兰氏阴性，因含有β-D半乳糖酶 ， 可 利 用 乳 糖 在 48 小 时 内 35℃ 之 下 产 生 气 体 和 酸，存于温血动物消化道下部，食品中如有大肠杆菌代表食品被粪便污染，所以卫生学上，常用于饮水、食品等卫生检定指标。 

　　饮用水中若含有大肠杆菌，表示水质受污染。因大肠杆菌于生长中可产生尿甘酸化物酵素，于选择性培养基3M PetrifilmTM 上之pH指示剂反应产生藍色气泡，而其他肠杆菌群以及出血型大肠杆菌不会产生此酵素，于培养基上发酵乳糖产酸，在酸的影响下pH指示剂会使培养基呈现暗红色。 

　　三、应用技术介绍 

　　一般试验中待测试样均含有多种物质，若要侦测特定物种，就必须藉由专一性反应才会有明显的结果，而生物传感器便符合这个需求，所谓生物传感器是利用生物组件所具备的专一性作为分析工具，再配合其他电 子 技 术 组 成 各 种 检 测 系 统 ， 如 何 将 生 物 活 性 分 子由物理反应讯号表示，即为生物传感器反应系统之主要目的，生物传感器之流程图显示于图 1。生物传感器之开端：葡萄糖生物传感器是由 Clark 及 Lyons 于公元 1962 年所开发出来（Clark andLyons，1962），有最早的血糖测试仪到后续开启了酵素电极生物传感器，而生物传感器包含了下列几项基本组件： 

　　1. 生物感测组件 

　　生物传感器有物理量测组件 （如金属 ）及化学感测组件 （如电位化学），利用此部分和待测物直接接触产生专一性反应，可细分为生物亲合性传感器及生物催化型传感器两种类型之传感器，例如葡萄糖生物传感器就是催化型传感器。一般的生物组件大多利用生体组织、微生物、胞器、细胞受体、酵素、抗原、抗体、组织等生化物质来侦测样品的存在。 

　　2. 换能器 

　　此部分将生物组件和待测物质反应后物理或化学量之改变，转变成电子讯号，而依物理及化学原理的不同又分为 ：光学、质量感应、热化学、电化学等，如以酵素标记的免疫传感器中，酵素与受质反应过程中产生的热能、吸收光、酸碱值及其他化学物质等变化，而换能器的功能在于将这些变化转变成电流讯号，在藉由纪录器提供待测物之特性及浓度。 

　　3. 讯号处理器 

　　在样品检测过程中会有须多外来物质或是样品本身杂质，都会干扰讯号造成判读上的误差，经由讯号处理器的处理会先将不必要的噪声排除，让判读过程中可以更精确。 

　　三、检测方法 

　　1. 直接镜检法 

　　当菌种培养到单一菌落时，可进行直接镜检法观察微生物的生长型态来鉴定病原菌。有些菌种的菌落比较小，也有些菌种的生长型态非常相似，往往会造成在显微镜下很难分辨，一般均会同时进行下述的培养法，以确保鉴定菌种的时效性与可靠性。 

　　2. 培养法 

　　所谓培养法须将菌体培养在胶质之固体培养基上，依菌体长到一定的菌落后，以观察菌种的生长型态及生理生化反应来辨别菌种。一般菌种的生长需要24至72小时的培养，才会长出明显的菌落。由于食品通常含有多种的微生物，故有时还须重新以增菌型培养基及选择性培养基加以分離各种菌种，最后再进行鉴定试验。此法须仰赖有经验的技术人员来选择适当的培养基及鉴定菌种，人力、经费及时间的花费相当可观。 

　　3. 膜过滤法 

　　一般使用滤纸孔径大小为0.45μm进行过滤，使液体样品中的微生物滞留在过滤膜上，再经过鉴别性培养基培养，之后由菌落外观颜色判定是否为大肠杆菌群，此法虽然可以过滤多种液体样品，但是菌落培养仍需花费一定时间才有结果，且样品中如掺杂有大量杂质、漂浮物，则会堵住滤膜孔隙，影响样品过滤。 

　　4. 酵素免疫检测法 

　　免疫检测法即藉抗原与抗体的结合特性进行免疫分析，较常见的为酵素免疫检测法，是利用酵素作为标记。首先将抗体固定于塑料材料制成的微量反应盘上，加入含抗原的待测物与其进行结合，再藉清洗将未结合的待测物移除，最后加入碱性磷酸酶之二次抗体及其受质，使其呈色来判断菌种。虽EIA具高特异性及高敏感性，然其反应步骤及清洗步骤极为繁复，易造成检验过程不易掌握之缺点，且基本上一次只能鉴定一种菌种，在在局限其应用。Chang & Huang （1997）是利用免疫检测法检测E. coli，其他方法如：（1）乳胶凝集作用； 将抗体与乳胶结合后观察抗原的凝集作用；（2）流体细胞计数：将抗体以荧光剂标示后藉流体细胞计数（或荧光显微镜）来检测微生物。 

　　5. 聚合酶连锁反应 

　　许多微生物检体都需经培养以取得较大量的样本后始能进行侦测，而PCR是一种可以在生物体外增殖DNA的技术，故被广泛的应用在人类基因的突变检测、微生物的侦测、动植物育种研究及开发新的医疗药品等方面，其优点为样品量小、敏感性高、特异性强且快速简便。PCR只需要微量的DNA样本，便可在数小时内将DNA增殖至好几百万倍；此法是利用两小段单股DNA片段作为引子，经过PCR的反复程序：变性、粘合及延伸，可将欲增殖的DNA片段以指数复制。一般PCR产物将经过电泳分離、溴化乙啶染色等处理后，以紫外光照射便可观察结果。此法的缺点在于不同的微生物需要用不同的引子进行PCR，使其实用化受到一定的限制。然已有利用此技术来鉴定 Proteus mirabilis，Bolton（2002）亦利用 此 技 术 配 合 EIA 由 食 品 中 检 测 Campylobacter jejuni 及 Campylobactercoli，比传统的方法为快。其他方法如多套式PCR虽可同时鉴定多种菌种，但多组的引子同时存在会增加引子之间互相干扰的机率，使PCR的靈敏度降低，且其他缺点为设备昂贵，前处理步骤复杂且费时，无论死菌或活菌均可检测出来，使检测结果可信度降低。