人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取与鉴定

    摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞(HUCMSC)来源外泌体的有效提取方法。方法：通过超速离心法从脐带干细胞培养上清液中分离外泌体，采用蛋白免疫印迹法、透射电镜对提取到的外泌体进行鉴定。结果：分离获得的外泌体特异富集蛋白CD9、TSG101等，透射电镜下可见其呈杯盘状结构，直径约30～100nm，有完整的膜结构，内含低密度物质。结论：HUCMSC分泌的外泌体，具有外泌体的经典结构及典型特征，并且易提取，操作方便，为未来脐带干细胞外泌体作为载体进行药物递送提供了实验依据。

    关键词：脐带间充质干细胞 外泌体 鉴定

    外泌体(exosomes)天然存在于体液中，含有丰富的蛋白质、RNA和DNA等，并能通过与靶组织受体结合或与质膜融合的方式介导细胞间信息交流，在多种疾病的发展过程中发挥关键作用[1]。外泌体作为一种无细胞(cell-free)的治疗方式，经过修饰等方式还可以利用其包裹药物靶向输送至特定部位，具有较高的应用潜能和价值[2]。目前临床将MSC外泌体作为药物递送的理想载体进行研究[3]。对于外泌体的提取目前的方法都有一定的局限性，如流失率较高、形态损伤较大、提取产量较低等，很难满足临床实际需求。脐带间充质干细胞(HUCMSC)来源的外泌体表现出在创伤修复和组织重建、炎症反应、缺血性疾病等方面丰富的治疗潜能[4]，且脐带组织来源丰富、取材较为容易。因此本实验拟对HUCMSC外泌体的提取及鉴定进行研究，以验证HUCMSC可作为外泌体体外大量制备的一种选择方法。

    资料与方法

    足月产新生儿脐带均来源于我院，经捐赠者知情同意，本研究经过医院医学伦理委员会批准。

    材料：DMEM/F12培养基、青霉素/链霉素双抗溶液、0.25%EDTA胰酶(GE，美国)；胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)，均为Gibco公司产品(美国)；RIPA裂解液、二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；2.5%戊二醛固定液(leagene，美国)；T25培养瓶(Corning，美国)；透射电子显微镜(FEI，美国)；倒置显微镜(Olympus，日本)；超速离心机、超速离心管(Beckman，美国)。

    方法：(1)HUCMSC的分离和培养：取新鲜的足月剖宫产新生儿脐带，用含有青霉素/链霉素双抗的PBS缓冲液反复冲洗，去除残留血液。将脐带组织剪成1mm3左右大小的碎片后转移到培养皿中，用含10%去外泌体胎牛血清(将FBS置于超速离心管中，4℃、120000g离心18h，吸取上层液体，-80℃分装保存备用)，1%双抗(100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素)的高糖DMEM培养基培养，放置在37℃5%CO2培养箱中24h，加入5mL培养基，每2～3d换液1次，7d后细胞生长状态利用倒置显微镜观察，汇合度达到80%～90%时，用0.25%EDTA胰酶消化，1∶3传代。P3～P7代细胞用于实验。(2)HUCMSC来源外泌体的分离：收集第3～5代HUCMSC细胞上清液100mL，分装于超速离心管中对外泌体进行提取、纯化。超速离心法具体步骤如下：离心10min(4℃，2000×g)后取上清液；上清液离心30min(4℃，1000×g)，随后用0.22μm滤器过滤上清液，取滤液；(4℃，100000×g)，弃去上清液，并收集底部沉淀于适量PBS中重悬；取上一步重悬液于4℃，100000×g离心2h，弃上清液，收集沉淀于适量PBS中重悬后-80℃冻存。(3)透射电镜观察外泌体形态、大小：取分离提取的外泌体20μL重悬液于塑料薄膜上，将铜网倒扣在液滴表面，静置10min后用滤纸缓慢将液体吸干，1%戊二醛液滴上负染5min，吸干液体并用双蒸馏水液滴洗涤铜网3次，3min/次，充分干燥，转移铜网至样品杆上样区，并于-80kV透射电镜下观察。(4)WesternBlot法鉴定外泌体表面标志物：取分离提取的外泌体适量，等体积加入RIPA细胞裂解液(含1%PMSF)，冰上裂解30min，离心(12000RPM,5min)，取上清液加入适量的4×蛋白上样缓冲液，煮沸10min；取处理后外泌体样本20μg于12%SDS-PAGE凝胶上电泳，结束后转移蛋白至PVDF膜上，并恒流(200mA)转膜80min，结束后用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2h，再按1∶1000加入一抗(CD9、TSG101),4℃摇床过夜。次日洗膜后加入二抗，孵育1h，洗膜4次(10min/次)，显影。

    结果

    间充质干细胞的形态学特征：细胞培养至第5代时可见细胞呈旋涡样生长，形态呈梭形，两头较细，中间较粗。见图1。

    图1脐带来源间充质干细胞镜下观察结果

    在透射电镜下观察到HUCMSC外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径约30～100nm，有完整的膜结构，内含低密度物质。见图2。

    图2外泌体透射电镜结果

    外泌体表面标记物鉴定：外泌体表面存在特异性标志物分子，如CD9、TSG101等。

    讨论

    外泌体在体内稳定，半衰期长，可作为负载药物和外源性核酸类物质的天然载体。目前，鲜见外泌体注射不良反应的报道。研究表明外泌体可作为神经系统疾病治疗的药物传递载体[5]。BM-MSC衍生的CD63+外泌体是Wnt3a在高Wnt环境中的重要载体[6]。因此，外泌体在基因治疗中作为运输载体的优势明显大于传统基因治疗载体[7]，在未来很可能成为一种应用广泛的基因运载体。

    间充质干细胞来源于骨髓、脂肪、脐带、经期脱落的子宫内膜等多种组织，具有较强的组织修复、促血管生成、调节免疫反应等能力，近年来研究发现MSC分泌的外泌体在上述过程中发挥了重要作用。虽然间充质干细胞来源外泌体已显示出较好的临床应用前景，然而仍有一些挑战需要克服，最常见的困难是分离外泌体的方法各异，没有相应的标准，并且耗时，得率也不高，需要大量的细胞和生物流体。由于HUCMSC的来源无伦理学限制，增殖速度快，容易实现产业化，是目前最具前景的间充质干细胞之一[8]。有研究显示，HUCMSC具有强大产生外泌体的能力，其外泌体产生是通过核内体途径实现的，首先在胞浆内形成初级核内体，经过包裹部分胞浆内成分后形成次级核内体(多泡体)，最后经过召集并与衔接蛋白Alix连接发育成熟，与质膜结合后释放到周围环境中[9]。

    本研究从新生儿脐带成功分离并鉴定了脐带干细胞来源的外泌体，该方法提取的间充质干细胞培养方法简单，分泌外泌体量较多，是用于组织修复再生研究的理想囊泡，同时也是用于药物装载递送研究的理想生物学载体。

    本研究证明人脐带来源的间充质干细胞培养简单，分泌外泌体量较多，为未来脐带干细胞来源外泌体作为载体递送药物治疗各项疾病的临床研究和应用提供了实验依据。

    参考文献

    [1] Garcia-Contreras M,Brooks RW,Boccuzzi L,et al.Exosomesas biomarkers and therapeutic tools for type 1 diabetes mellitus[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(12):2940-2956.

    [2] Shahabipour F,Barati N,Johnston TP,et al.Exosomes:Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery[J].J Cell Physiol,2017,232(7):1660.

    [3] Yeo RW,Lai RC,Zhang B,et al.Mesenchymal stem cell:an efficient mass producer of exosomes for drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev,2013,65(3):336-341.

    [4] Phinney DG,Pittenger MF.Concise review:MSC-derivedexosomes for cell-free therapy[J].Stem Cells,2017,35(4):851-858.

    [5] Izadpanah M,Seddigh A,Ebrahimi Barough S,et al.Potential of Extracellular Vesicles in Neurodegenerative Diseases:Diagnostic and Therapeutic Indications[J].Journal of Molecular Neuroscience,2018(66):172-179.

    [6] Jeffrey D Mc Bride,Luis Rodriguez-Menocal,Wellington Guzman,et al.Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived CD63+Exosomes Transport Wnt3a Exteriorly and Enhance Dermal Fibroblast Proliferation,Migration,and Angiogenesis In Vitro[J].Stem Cells and Development, 2017(26):1384-1398.

    [7] Rezaie J.Exosomes and their Application in Biomedical Field:Difficulties and Advantages[J].Molecular Neurobiology, 2018(55):3372-3393.

    [8]杨大志,易伟宏.人脐带间充质干细胞多向分化能力的研究和应用进展[J].湖北医药学院学报,2015,34(3):313-318.

    [9]张娟,史晋叔,李剑.间充质干细胞源性外泌体-未来生物疗法的理想载体[J].中国实验血液学杂志,2015,23(4):1179-1183.