宫内慢性缺氧对成年雄性大鼠心肌细胞eNOS表达及磷酸化的影响

摘    要：目的 研究宫内慢性缺氧对成年期雄性心肌细胞内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）表达和磷酸化水平的不良作用。方法 健康SD孕鼠于孕期第7天随机分为缺氧组（21%O2,n=6）、对照组[（10.0±0.5）%O2,n=6]，缺氧组于低氧舱内进行缺氧暴露，每日维持8 h。重复上述过程直至孕鼠分娩（妊娠第21天）。选取子代雄性大鼠各6只，正常喂养至11月龄。蛋白质印迹法测定成年雄性大鼠心肌细胞的3个位点表达，即e NOS、e NOS苏氨酸495位点（Threonine 495 loci,Thr495）、eNOS丝氨酸1177位点（Serine1177 loci,Ser1177）。结果 与对照组相比，宫内缺氧组心肌细胞eNOS蛋白水平表达[（1.032±0.185）vs.(1.473±0.141)]、eNOS Ser1177磷酸化程度[（0.239±0.078）vs.(0.672±0.087)]均减少，而eNOS Thr495磷酸化程度[（0.638±0.149）vs.(0.208±0.109)]上升（P均<0.001）。结论 宫内慢性缺氧下调心肌细胞e NOS蛋白、eNOS Ser1177的表达；上调心肌细胞eNOS Thr495表达。
关键词：内皮型一氧化氮合酶 宫内慢性缺氧 eNOS丝氨酸1177位点 磷酸化 eNOS苏氨酸495位点

有前沿学者曾调研过流行病学特征，不健康子宫内环境对胎儿期的影响会导致儿童期易患疾病外，还会增加成人时期感染非传染性疾病的风险[1]。如果胎儿持续暴露于不利的宫内环境，包括氧气和营养因素，会使生理系统复位，导致心肌细胞数量和表观遗传的改变，从而导致成年后心血管疾病[2-3]。作为一氧化氮合酶的亚型之一，e NOS在引起心血管疾病的同时，若e NOS表达下降或生物活性下降，可引起血管内皮功能障碍[4]。磷酸化调控会干扰e NOS的活性在转录、翻译阶段，尤其是丝氨酸1177位点（Ser1177）和苏氨酸495位点（Thr495)2个位点[5]。本研究在前人基础上，通过研究e NOS分子活性修饰途径即磷酸化的改变，以期探索面对宫内缺氧时e NOS活性改变的相应分子机制及成人疾病编程的研究。

1 材料与方法

1.1 缺氧模型建立与分组
由上海斯莱克实验动物公司提供清洁级SD雌性孕鼠12只，孕龄7 d，通过随机数字表随机分为缺氧组与对照组（各n=6）。建立宫内慢性缺氧模型，6只孕鼠置于缺氧舱内，每日8 h持续缺氧，箱内氧浓度为（10.0±0.5）%。常氧对照组的6只孕鼠也置于相同的玻璃箱内，持续通入空气[6]。
1.2 动物标本采集
按随机数字表法在生产后于每窝刚生产后的大鼠里选取1只雄性，经过11个月的饲养，到实验结束时，对照组有6只存活，缺氧组有5只存活。将动物麻醉之后迅速取出心脏，仅保留室间隔及左心室，固定于10%的甲醛溶液，脱水、包埋室温备用，余标本液氮中速冻后转存于-80℃冰箱备检。
1.3 Western Blot法测定e NOS、e NOS(Thr495）、e NOS(ser1177）表达
配置试剂后组织切块加入裂解液，待充分裂解后进行离心取上清，用考马斯亮蓝法测定各细胞样本蛋白含量，进行蛋白样品变性、电泳，封闭1 h后用一抗用封闭液稀释（内参抗体稀释度为1∶1 000），洗膜后将一抗反应膜放入二抗工作液中，用image J软件分析灰度值（抗体及试剂盒分别由美国Zymed Laboratories公司、江苏厚普生物公司提供）。
1.4 统计方法
使用spss22.0统计软件对数据进行分析：计量资料用（±s）描述，行t检验。当P<0.05时，表示存在统计学差别。

2 结果

Western Blot法测定e NOS、Ser1177、Thr495表达结果以Western Blot依次检测e NOS、Thr495、Ser1177表达（图1）。可见Thr495位点磷酸化程度有所升高而Ser1177位点磷酸化程度有所降低（图2）。

图1 Western Blot法检测e NOS、Thr495、Ser1177表达

图2 Western Blot法测定e NOS、Ser1177、Thr495表达结果

3 讨论

目前认为宫内慢性缺氧通常以变动e NOS及其分子伴侣，如CAV-1、HSP90、血清内皮素-1、CAM的表达，从而导致成人发生心血管疾病[7-8]。作为调控e NOS活性的重要途径之一，宫内慢性缺氧过程中的e NOS磷酸化尚未见报道。
本研究发现，宫内慢性缺氧将导致雄性成年期出现e NOS蛋白表达下降，故提示宫内慢性缺氧对机体作用时间长，效果显著，e NOS表达降低后会减少NO生成，心血管系统没有NO的保护作用，会从胎儿期一直持续到中年，这可能是控制成人慢性宫内缺氧所致心血管疾病发生的机制[9-10]。
e NOS在翻译后修饰阶段有着复杂的模式，蛋白激酶与蛋白磷酸酶传导的去磷酸化及磷酸化网络充当对e NOS活性进行调节的重要翻译后修饰[11-12]。磷酸化程度则直接影响e NOS与钙调蛋白的结合力[13-14]。一方面蛋白激酶-B、蛋白激酶-A和钙调蛋白都能在Ser1177位点磷酸化e NOS，从而增强e NOS与钙调素的结合。另一方面，此外，蛋白激酶-A和蛋白激酶-C通道传导THR495位点的e NOS磷酸化受到抑制，影响其和Ca M结合在一起。细胞受刺激之后往往引发Thr495迅速去磷酸化，以推动Ca M与e NOS结合生成NO。故e NOS活性与Ser1177和Thr495互相之间的磷酸化/去磷酸化程度相关。
综上所述，慢性宫内缺氧可显著下调成年雄性大鼠心肌细胞e NOS蛋白和e NOS Ser1177的表达，上调成年雄性大鼠心肌细胞e NOS Thr495的表达。

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