响应面法优化繁缕中总黄酮提取工艺及体外抗氧化作用研究

摘要：用响应面法优化繁缕［Stellariamedia（L.）Cyr.］中总黄酮类化合物的提取工艺，通过羟自由基、超氧阴离子自由基、总还原力试验测定繁缕中总黄酮的体外抗氧化作用，并与抗坏血酸和叔丁基对苯二酚的抗氧化能力进行比较。结果表明，提取工艺最佳条件为提取温度86℃、提取时间2.5h、液料比V乙醇∶m繁缕粉为31.5∶1（mL∶g）、提取2次，该条件下总黄酮提取率预测值为3.907%，验证值为3.879%。繁缕中总黄酮的还原能力、对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力均表现出较好的效果，清除超氧阴离子自由基和羟自由基的IC50分别为0.583mg/mL和0.626mg/mL，其抗氧化能力高于维生素C和叔丁基对苯二酚。

　　关键词：繁缕［Stellariamedia（L.）Cyr.］；黄酮；响应面法；抗氧化作用

　　繁缕［Stellariamedia（L.）Cyr.］又名鸡草，是石竹科（Caryophyllaceae）繁缕属（Stellaria）植物，生长于田间、路旁、林缘或溪边草地，几乎遍布全国各地［1］。该植物全草入药，具有清热解毒、活血化瘀、止痛、下乳、催生之功能。适用于治疗痢疾、肠痈、肺痈、乳痈、疔疮毒痛、痔疮肿痛、出血、跌打损伤、产后瘀血腹痛、乳汁不下、乳腺炎、暑热呕吐等疾病［2-5］。繁缕含有黄酮、多糖、皂苷、脂肪酸、植物甾醇、维生素、氨基酸、微量元素等多种营养成分［6-11］，是一种很受大众欢迎的无污染、高品质的野生蔬菜，具有很好的营养、保健及药用价值。目前对繁缕的研究主要集中在化学成分及分析方法、除草方法和除草药剂、用分子生物学方法对繁缕进行鉴定等3个方面［12］，还没有针对繁缕中总黄酮提取工艺的研究。本试验对繁缕黄酮提取方法进行了研究，以期通过单因素和响应面试验确定各影响因素，优化繁缕黄酮的提取工艺，研究繁缕黄酮的抗氧化作用，为繁缕的开发利用及深入研究提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器

　　繁缕嫩茎叶采自江苏省连云港市花果山，洗净在60℃于电热恒温鼓风干燥箱中烘干至质量恒定，粉碎过60目筛。用石油醚浸泡去色，反复浸泡至无色，余下的固体粉末挥发干备用。

　　芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所；维生素C、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、邻苯三酚、水杨酸、硫代巴比妥酸、三羟基氨基甲烷、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、乙醇、石油醚、丙酮、氯仿等购自上海国药集团试剂公司。

　　UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；RE-5285A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；TDL-4型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

　　1.2试验方法

　　1.2.1黄酮提取工艺流程繁缕干粉→过筛→乙醇提取→离心→滤液→减压浓缩→提取液定容→测定总黄酮含量。

　　具体操作步骤：称取繁缕干粉5g，置于三口瓶中，加入50%乙醇提取2次，浓缩提取液并定容，测定黄酮含量。

　　1.2.2总黄酮提取率的测定以芦丁为标准品，参照文献［13］得到芦丁质量浓度（C）在5～40mg/L范围内对其在363nm波长处吸光度（A）的标准曲线回归方程为：A＝0.0017＋0.0262C，r＝0.9994。测定佛手总黄酮提取液的吸光值A363nm，计算其中的总黄酮含量得到其提取率。

　　总黄酮提取率＝提取液中总黄酮含量×稀释倍数×体积／原料质量×100％。

　　1.2.3单因素试验以繁缕中总黄酮提取率为指标分别考察乙醇溶液浓度、液料比（V乙醇：m繁缕粉，mL：g，下同）、提取温度、提取时间和提取次数对总黄酮提取率的影响，进行单因素试验。①乙醇浓度对繁缕中总黄酮提取率的影响。在提取温度70℃、提取时间1h、液料比25∶1、提取1次的条件下，研究不同浓度乙醇（40％、50％、60％、70％、80％）对繁缕中总黄酮提取率的影响。②提取时间对繁缕中总黄酮提取率的影响。在提取温度70℃、液料比25∶1、提取1次、50％乙醇作提取溶剂的条件下，研究不同提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h）对繁缕中总黄酮提取率的影响。③提取温度对繁缕中总黄酮提取率的影响。在液料比25∶1、提取1次、50％乙醇作提取溶剂、提取时间2h的条件下，研究不同提取温度（50、60、70、80、90℃）对繁缕中总黄酮提取率的影响。④液料比对繁缕中总黄酮提取率的影响。在提取1次、50％乙醇作提取溶剂、提取时间2h、提取温度70℃的条件下，研究不同液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）对繁缕中总黄酮提取率的影响。⑤颗粒大小。在提取温度70℃、液料比25∶1、提取1次、50％乙醇作提取溶剂、提取时间2h的条件下，研究不同原料颗粒（20、40、60、80目）对繁缕中总黄酮提取率的影响。

　　1.2.4响应面优化试验在单因素试验基础上，选取液料比、提取温度、提取时间为Box-Behnken设计的自变量，繁缕黄酮提取率为响应值进行响应面优化组合。因素与水平见表1，数据采用DesignExpert8.05统计软件分析。

　　1.2.5繁缕中总黄酮的抗氧化活性测定将提取液浓缩，烘干，用丙酮、氯仿等溶剂淋洗后，低温干燥，配成黄酮质量浓度500mg/L的储备液，用于抗氧化活性测定。以维生素C和TBHQ为对照，还原力、羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率的测定方法见文献［14］。

　　2结果与分析

　　2.1单因素试验结果

　　2.1.1乙醇溶液对繁缕中总黄酮提取率的影响在提取温度70℃、提取时间1h、液料比25∶1的条件下，加入不同浓度的乙醇提取黄酮1次，定容测定吸光度，结果见图1。由图1可知，繁缕中总黄酮提取率随乙醇浓度的增大先升高，在乙醇浓度为50％时总黄酮提取率最高，之后再增加乙醇浓度，总黄酮提取率反而下降，故乙醇浓度选择50％为宜。

　　2.1.2提取时间对繁缕中总黄酮提取率的影响以50％乙醇作为提取溶剂，考察不同提取时间对总黄酮提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，总黄酮提取率随提取时间的延长先升高，提取时间超过2.5h后总黄酮提取率不再升高，反而略有下降。因此，提取时间以2.5h为宜。

　　2.1.3提取温度对繁缕中总黄酮提取率的影响由图3可知，总黄酮提取率随着提取温度的升高呈先升高后下降的趋势，提取温度为80℃时，总黄酮提取率最高，因此提取温度以80℃为宜。

　　2.1.4液料比对繁缕中总黄酮提取率的影响由图4可知，繁缕中总黄酮提取率随提取溶剂用量的增大也呈先升高后下降的趋势，V乙醇∶m繁缕粉为30∶1时黄酮提取率最大。因此以V乙醇∶m繁缕粉为30∶1为宜。

　　2.1.5颗粒大小对繁缕中总黄酮提取率的影响由图5可知，随颗粒尺寸减小，总黄酮提取率增加，颗粒尺寸达60目时黄酮提取率最高。当颗粒尺寸继续减小时黄酮含量反而下降，可能是颗粒尺寸过小，接触面积过大，致使繁缕中其他物质也被萃取出来［15］，因此繁缕颗粒以60目为宜。

　　2.2响应面优化试验结果

　　响应面试验优化繁缕中总黄酮提取条件的结果见表2。将所得的试验数据用DesignExpert软件进行多元回归拟合，得到繁缕中总黄酮提取率对提取温度（A）、提取时间（B）、液料比（C）的二次多项回归方程：Y＝3.7550－0.3966A－0.0283B＋0.2290C－0.0415AB＋0.1372AC－0.0582BC－0.3737A2－0.7463B2－0.5135C2。

　　由回归模型的响应面图（图6）可以看出，总黄酮提取率随着各两因素的增加先呈上升趋势，当各两因素达到某一水平时，总黄酮提取率增加缓慢，随后下降。等高线的形状可反映交互作用的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图6可见，AC两因素交互作用的等高线呈椭圆形，表明这两个因素之间有明显的交互作用。

　　通过软件Design－Expert求解回归方程，得到黄酮的最佳提取工艺条件为提取温度85.89℃、提取时间2.48h、V乙醇∶m繁缕粉＝31.52∶1，繁缕中黄酮提取率理论最高值可达3.907％。考虑实际操作情况，将试验条件修改为提取温度86℃、提取时间2.5h、V乙醇∶m繁缕粉＝31.5∶1。在此条件下以50％乙醇溶液作提取溶剂，提取2次，重复3次，所得繁缕中总黄酮提取率3.879％，与预测值偏差较小，证明该模型用于优化筛选繁缕中总黄酮提取率提取工艺是可行的。

　　2.3体外抗氧化试验结果

　　2.3.1繁缕中总黄酮的还原能力由图7可知，在试验质量浓度范围内，繁缕黄酮的还原能力与质量浓度呈线性关系。在样品质量浓度小于0.2mg/mL时，对Fe3+的还原作用能力大小顺序为TBHQ＞繁缕黄酮＞维生素C，当样品质量浓度大于0.2mg/mL时，对Fe3+的还原作用能力大小顺序为繁缕黄酮＞TBHQ＞维生素C。说明繁缕黄酮的抗氧化性强于TBHQ和维生素C。

　　2.3.2羟自由基清除能力由图8可知，在所选质量浓度范围内，随着繁缕黄酮质量浓度的增加，对羟自由基的清除效果增强。根据线性回归方程可以得到繁缕黄酮清除羟自由基的IC50为0.626mg/mL，维生素C的IC50为0.657mg/mL，TBHQ的IC50为0.799mg/mL，说明繁缕黄酮清除羟自由基的能力高于TBHQ，与维生素C的能力相近。

　　2.3.3超氧阴离子自由基清除能力从图9可知，在所选质量浓度范围内，随着繁缕黄酮质量浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用增强，呈现量效关系。繁缕黄酮的IC50为0.583mg/mL，维生素C的IC50为0.742mg/mL，TBHQ的IC50为0.832mg/mL。由此可见繁缕黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力比维生素C和TBHQ高。

　　3小结与讨论

　　利用响应面法优化繁缕黄酮的提取率，得到的最佳提取工艺修正条件为提取温度86℃、提取时间2.5h、V乙醇∶m繁缕粉＝31.5∶1。经验证该模型拟合程度高，准确有效。

　　体外抗氧化试验结果表明，繁缕黄酮具有较强的还原能力、超氧阴离子自由基清除能力和羟自由基清除能力。与同质量浓度维生素C和TBHQ相比，繁缕黄酮的超氧自由基清除能力和还原能力更强，而羟自由基清除能力与维生素C相近，但高于TBHQ。

　　繁缕广泛分布在中国各地，野生资源非常丰富、成本低廉，作为一种潜在黄酮的提取源和抗氧化剂，具有广泛的应用前景和开发价值。

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