D—甘露糖电化学阻抗生物传感器的研究

摘要：糖类的研究已经成为生物及化学领域一个新的热点。凝集素与糖类之间的作用是生命活动中一个重要的部分。试验设计了一种比较简单的D-甘露糖电化学阻抗传感器，以刀豆凝集素为分子识别物质，共价键合法将刀豆凝集素固定到金圆盘电极的表面，用电化学阻抗法进行检测。结果表明，以

　　[Fe（CN）6]3-/4-氧化还原电对作为探针，电子转移阻抗变化值与D-甘露糖的浓度之间呈现良好的线性关系。

　　关键词：电化学传感器；阻抗；刀豆凝集素；D-甘露糖

　　中图分类号：TP212.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1136-03

　　细胞表面的糖化合物不仅在正常细胞的识别、细胞黏附和细胞间信号传导等方面具有重要作用，而且在细胞病变、病原感染等研究方面亦有重要意义。因此，研究生物体内糖类物质的变化是一个非常重要的问题。近几年来，凝集素与糖类物质之间特异性的相互作用引起了人们广泛的关注。利用凝集素结合特性可以提供糖链末端结构的信息，且具有特异、敏感、快速的特点[1]。本试验设计了以刀豆凝集素为分子识别物质，测定D-甘露糖的电化学交流阻抗生物传感器。电化学交流阻抗技术是一种对电极界面性质变化十分敏感而便捷的检测技术，能够提供有关电极界面电子传递电阻，双电层电容等多种界面参数的大量信息，而且是一种非标记的技术，具有简单且无需标记等优点[2]。试验利用刀豆凝集素与甘露糖的特异性相互作用，将半胱氨酸固定到电极表面之后，在N-（3-二甲氨基）-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的作用下，将半胱氨酸的羧基转化为酰基[3]，然后与刀豆凝集素的氨基形成酰氨键，从而将刀豆凝集素固定到电极表面，以检测甘露糖。该传感器电子转移阻抗改变值与D-甘露糖的浓度之间呈现良好的线性关系，为D-甘露糖的检测提供了新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　刀豆凝集素A（Concanavalin A，ConA）、N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐[N-（3-Dimethylaminopropyl）-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]购自Sigma公司；D-甘露糖 （C6H12O6）、半胱氨酸（Cysteine，CS）购自Alfa Aesar公司。N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccimide，NHS）购自上海丽珠东风生物技术有限公司。缓冲液为0.10 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7.40）-10 mmol/L KCl。用0.10 mol/L PBS（pH 7.40）来配制5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]检测溶液。

　　NHS和EDC均使用0.10 mol/L PBS-10 mol/L KCl （pH 7.40）配制。其他试剂均为分析纯，试验所用溶液均用超纯水配制。

　　刀豆凝集素的活化[4]：刀豆凝集素使用前用0.1 mmol/ L的Ca2+、Mn2+活化6 h。

　　电化学分析系统：CHI 660电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）。电极为三电极系统，工作电极为金圆盘电极（Φ=2.0 mm），对极为铂丝，参比电极为银/氯化银电极（Ag/AgCl 饱和KCl）。

　　1.2 金圆盘电极预处理

　　将金电极用0.03 ？滋m Al2O3溶胶研磨，然后用水冲洗；再将冲洗后的金电极在0.10 mol /L H2SO4溶液中在电位范围0～1.6 V，循环伏安扫描直到得到标准金的还原峰，用二次水冲洗干净备用[5]。

　　1.3 生物传感器的制备

　　将预处理好的金电极浸入0.02 mol/L半胱胺酸溶液中浸泡16 h，然后用水冲洗，使金电极表面形成带正电的自组装膜[1]（CS/Au），再将100 μL 40 mmol/L的EDC和10 mmol/ L的NHS的混合溶液滴加在CS/金电极上，使金电极表面的半胱胺酸得到活化，室温下静置1 h[6]，然后用水冲洗（EDC-NHS/CS/ Au）；再将活化后的CS/金电极在ConA溶液中浸泡1 h，利用活化后的CS与带氨基的ConA共价键合结合，将ConA共价键合法固定在电极表面制备成传感器（ConA/EDC-NHS/CS/ Au），如图1所示。待用。

　　2 结果与分析

　　2.1 循环伏安法表征

　　图2为传感器制备过程中，不同修饰电极在5 mmol /L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]中的循环伏安图。从图2中可以看出，裸金电极的氧化还原峰电位差△E=0.083 1 V，当在金电极自组装了CS后，EDC+NHS/CS/Au上固定了刀豆凝集素之后，[Fe（CN）6]3-/4-平衡电对的氧化峰电流降低，原因是刀豆凝集素的等电点pI为4.5～5.0，在中性条件下（pH 7.40）会带负电，因此，对荷负电的[Fe（CN）6]3-/4-平衡电对存在静电排斥作用，使得氧化电流较固定有EDC+NHS/CS/Au的电极降低。当加入D-甘露糖之后，[Fe（CN）6]3-/4-平衡电对的氧化峰电流继续降低。这可能是由于刀豆凝集素结合D-甘露糖之后，空间位阻变大，导致[Fe（CN）6]3-/4-平衡电对在电极上的电子转移受到阻碍。

　　2.2 交流阻抗法表征

　　图3为传感器制备过程中，不同修饰电极在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]中的复平面阻抗图。从图3可以看出，EDC+NHS/CS/Au的阻抗谱几乎为一直线，表明在此情况下，反应是受扩散控制的过程，平衡电对非常容易到达电极的表面发生反应，电极上不存在阻挡电子传递的物质。这说明羧基酰基化后带正电，吸引电子，阻抗值变小。而当结合ConA之后，Nyquist图上高频区半圆增大。这一现象归因于ConA本身分子比较大，电极表面的空间位阻就会变大，阻碍平衡电对向电极表面传递，使表面电子传递电阻Ret增大。

　　从不同电极的循环伏安图及交流阻抗图中可以看出，在ConA固定到电极的过程中，电极表面的阻抗增大，电子传递速度变慢，而不同浓度的甘露糖结合到电极上之后，也会引起阻抗值的变化，这表明本试验设计的D-甘露糖电化学交流阻抗传感器能用于甘露糖的检测。

　　2.3 传感器的线性范围

　　利用共价键合法制备电化学传感器对不同浓度的D-甘露糖进行测定。图4为EDC+NHS/ConA/CS/金电极对不同浓度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗图，内插图为阻抗差值与D-甘露糖浓度对数值之间的线性关系图。从图4中可见，EDC加NHS共价键和来固定刀豆凝集素的方法在甘露糖为5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之间呈良好的线性关系。阻抗差值（y）与D-甘露糖的浓度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之间也呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=521.5x+4 486.7，线性相关系数为0.975 7。

　　3 结论

　　本试验通过共价键和的方式，将刀豆凝集素固定到金电极的表面，研制了一种简单、灵敏的测定D-甘露糖的电化学阻抗传感器。该传感器电子转移阻抗改变值与D-甘露糖的浓度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之间呈现良好的线性关系。试验结果表明，刀豆凝集素与甘露糖的特异性相互作用能够应用于对甘露糖的定量检测，并获得了较高的灵敏度，为D-甘露糖的检测提供了新思路。

　　参考文献：

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　　[3] BELLE J T， GERLACH J Q， SVROVSKY S，et al. Label-free lmpedimetric detection of glycan lectin interactions[J]. Anal Chem，2007，79（18）：6959-6964.

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　　[6] 郭萌萌，杨云慧，王志杰，等. 基于伴刀豆球蛋白固定过氧化物酶无介体新型生物传感器的研制[J].分析化学，2006，34（3）：399-402.