几株水产用芽孢杆菌的功能分析

　　摘 要：芽孢杆菌由于功能性强，作用明显，被广泛应用于水产养殖中。为得到一株能有效净化养殖水环境的菌株，本试验从7株芽孢杆菌中筛选出具有高效降氨氮、亚硝态氮、产酶的菌种，其中C24的氨氮去除率达到75%；C22的亚硝态氮去除率可达64%；C12和C13产蛋白酶、淀粉酶能力突出。研究认为可作为水产微生物制剂的候选菌种。 

　　关键词：氨氮；亚硝酸盐；微生物制剂；水产养殖 

　　近年来，我国水产养殖业不断发展，随着养殖规模逐渐扩大，养殖密集度、继续恶化程度的加深，养殖环境与水浴生态环境的矛盾也日益突出。我国的水产养殖方式大多为静水养殖，养殖动物的活动、摄食、排泄都在同一池塘内进行，并且以单一品种高密度养殖为主，严重破坏了生态系统的平衡[1]。在高密度养殖中，由于饲料的过量投喂，水产动物排泄物的积累以及渔药滥用，使得养殖水体不断恶化[2]。水体污染物有来自于余料残饵中残留的蛋白质和淀粉，养殖动物粪便、残饵分解及肥料中的大量氨氮、亚硝酸氮和硫化物等，水质好坏直接关系着水产养殖的经济效益。而如何调节和改善水体环境，降低和去除水体污染物（有机物、氨氮、亚硝酸盐）已经成为净化养殖水质的研究热点[3]。就目前来看，用传统的物理及化学方法处理水体氨氮污染，虽然见效快，但投入较大，且容易引起二次污染，而利用微生物调节养殖水体水质被认为是目前最为经济、生态、环保的方法[4-6]。 

　　芽孢杆菌因其具有生长速度快、易培养、抗逆性强等优点，已被越来越多的人所关注，芽孢杆菌具有高活性的消化酶系，能够分解养殖水体中的各种大分子有机物，谢航等研究表明，地衣芽孢杆菌在适宜的水体生态条件下对饲料残饵中的蛋白质与淀粉降解率为60%左右[7]。有些芽孢杆菌还能降解水体中的氨氮和亚硝酸氮等有毒物质，净化水质，有研究表明，巨大芽孢杆菌在氨氮初始浓度为50 mg·L-1的环境下，24 h的氨氮降解率在95%以上[8]。同时芽孢杆菌还能抑制某些病原微生物的生长[9]，提高免疫力，使养殖动物免受病害。因此，芽孢杆菌作为水产微生物制剂的菌株具有广阔的应用前景[10]。 

　　本试验探究几株市售产品中分离的芽孢杆菌的功能，研究它们的生长稳定性、有机物分解能力和氨氮、亚硝酸氮去除能力，为以后开发研制高效净水微生物制剂提供理论依据。 

　　1 材料和方法 

　　1.1 试验材料 

　　菌种：从不同种市售芽孢杆菌产品中提取分离得到7株芽孢杆菌，分别是C10-2、C12、C13、C15、C22、C23和C24。留种保存。 

　　主要培养基如下。 

　　（1）牛肉膏蛋白胨培养基（g·L-1）：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，固体培养基加1.5%的琼脂。 

　　（2）生长速度测定培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 1 g，（NH4）2SO4 10 g，酵母膏0.5 g，MgSO4 0.4 g，水1 000 mL，pH 值7.0～7.2、115 ℃灭菌30 min。 

　　（3）酪素水解培养基（g·L-1）：脱脂奶粉50 g，固体培养基加1.5%的琼脂。 

　　（4）淀粉水解培养基（g·L-1）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，固体培养基加1.5%的琼脂。 

　　（5）卵磷脂酶测定培养基（g·L-1）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，体积比1∶1的卵黄盐水溶液50 mL，固体培养基加1.5%的琼脂。 

　　（6）耐盐性培养基：含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基。 

　　（7）耐碱性培养基：pH值为10的牛肉膏蛋白胨液体培养基。 

　　（8）氨氮降解筛选和测定培养基（g·L-1）：葡萄糖5.0 g，NH4Cl 2.0 g，NaCl 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.2 g， pH 值7.0～7.5，固体培养基加1.5%的琼脂。 

　　（9）亚硝酸氮测定培养基（g·L-1）：葡萄糖4.0 g，NaNO2 0.5 g，K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4 0.2 g，蛋白胨1.0 g， pH 值7.0～7.5，固体培养基加1.5%的琼脂。 

　　1.2 试验方法 

　　1.2.1 菌种活化 在无菌条件下取适量菌种接种于20 mL牛肉膏蛋白胨培养基，28 ℃，100 r·min-1摇床振荡培养24 h（厌氧菌28 ℃静置培养72 h），于4 ℃保存。 

　　1.2.2 微生物生长速率试验 取活化后的菌液各200 μL，分别接种于20 mL培养基，28 ℃、100 r·min-1摇床振荡培养（厌氧菌静置培养）12和24 h（厌氧菌培养24和72 h），无菌条件下取适量菌液测定菌液浓度。 

　　1.2.3 有机物分解试验 各取5 μL活化好的菌液，分别点种在酪素平板、淀粉平板和卵磷脂平板上，每个平板上点种3个点，置于28 ℃培养箱内倒置培养24 h（厌氧菌培养72 h），并观察试验结果。 

　　1.2.4 耐盐耐碱性试验 取活化后的菌液各200 μL，分别接种于20 mL含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基和pH 值为10的牛肉膏蛋白胨液体培养基上，于28 ℃、100 ·min-1摇床振荡培养（厌氧菌静置培养），培养 24 h（厌氧菌培养72 h）。 

　　1.2.5 抑菌性试验 采用滤纸片法分别浸润芽孢菌悬液，贴在涂有待抑制4种致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌）平板上，28 ℃倒置培养24 h（厌氧菌培养72 h），观察有无抑菌圈及抑菌圈大小。 

　　1.2.6 氨氮含量测定试验 取适当稀释的菌悬液0.1 mL涂布在氨氮筛选培养基平板上，28 ℃倒置培养24 h，观察菌种生长情况。选取能够在氨氮筛选固体培养基中生长的菌种，并取其菌悬液0.5 mL接种于20 mL的氨氮测定培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃、120 r·min-1振荡培养（C22 28 ℃厌氧静置培养）24 h。菌液适当稀释后测定氨氮含量，氨氮测定方法为次溴酸盐氧化法（参照GB 17378.4—2007）。 

　　1.2.7 亚硝酸氮含量测定试验 取0.5 mL活化好的不同菌种，分别接种于20 mL的亚硝酸氮测定培养基1和2的100 mL三角瓶中，于28 ℃、120 r·min-1振荡培养（C22于28 ℃厌氧静置培养）24 h，适当稀释后测定菌液浓度OD600和菌液的亚硝酸氮含量。亚硝酸氮测定方法为萘乙二胺分光光度法。 

　　2 结果与分析 

　　2.1 芽孢杆菌生长的测定 

　　从图1可知，C22为厌氧菌，生长情况较差，其余菌种生长情况良好。其中：C24在24 h的菌液浓度最大，生长情况最好；C15前期生长较差，24 h生长旺盛；C10-2、C12、C13和C23前后菌浓度差别不大。 

　　2.2 不同芽孢杆菌酶活能力的测定 

　　如表1所示：所有菌种都有分泌蛋白酶的能力，C22分泌蛋白能力较差；从产淀粉酶的能力来看，C15、C22产淀粉酶能力非常弱，无法看到淀粉水解的透明圈，其余菌种都有较强的淀粉水解能力；从产卵磷脂酶的能力来看，C23、C24产卵磷脂能力很强，C10-2、C12和C13产卵磷脂酶能力次之，C22对卵磷脂的降解能力较小，C15不产生卵磷脂酶。 

　　2.3 不同芽孢杆菌的耐盐性试验 

　　如表2所示，在耐盐性试验中，除了C24试验组（含3%NaCl）的生长情况好于对照组（含0.5%NaCl）之外，其余菌种在对照组中的生长情况好于试验组，C22的生长情况较其余菌种的生长浓度小的多。 

　　2.4 不同芽孢杆菌的耐碱性试验 

　　如表3所示，在耐碱性试验中，对照组（普通牛肉膏蛋白胨培养基）的生长情况很好，试验组（pH10的牛肉膏蛋白胨培养基）基本没有生长，C22的生长结果在两组均较差。 

　　2.5 不同芽孢杆菌的抑菌试验 

　　抑菌试验结果：7个菌种对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌结果如表4所示。 

　　在金黄色葡萄球菌的抑菌试验中，可以看出C10-2、C12和C13的抑菌效果较好，C22、C23和C24的抑菌效果稍差一些，C15没有抑菌效果。 

　　2.6 不同芽孢杆菌的氨氮降解试验 

　　7种芽孢杆菌在氨氮筛选平板上均有菌落出现，表明这7种芽孢杆菌都能以NH4Cl作为氮源生长，具有去除氨氮的能力，需要对其去除氨氮能力进行定量测定。试验结果显示（表5）：不同菌种培养24 h均有良好的生长；经过24 h的培养，不同菌种对氨氮的降解率均达到50%以上，其中C12、C22、C23和C24对氨氮降解率可以达到70%。 

　　2.7 不同芽孢杆菌的亚硝酸氮降解试验 

　　如表6所示，不同菌种经过24 h培养后，菌种均有生长，但生长浓度不高；亚硝酸氮的降解率最好的是C22，达到64.4%，C13的亚硝酸降解率最差，其余菌种的降解率均不高。 

　　3 结论与讨论 

　　有许多研究表明，芽孢杆菌具有降低氨氮和大分子有机物的能力，枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌具有明显的去除氨氮和亚硝酸氮的功能，利用枯草芽孢杆菌制剂改良罗氏沼虾养殖池塘水质，氨氮最大降解率为59.61%，亚硝态氮的最大降解率为86.70%，地衣芽孢杆菌可以有效地分解残饵中的蛋白质和淀粉；芽孢杆菌还可促进微藻、颤藻等有益藻类的生长，抑制嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等水产致病菌的繁殖扩散[11-12]。此外，芽孢杆菌对养殖动物还有益生作用，像一些短小芽孢杆菌可以作为水产动物的促生长添加剂，添加芽孢杆菌的饲料可以更明显地提升其在养殖动物肠道中的作用。例如在饲料中添加枯草芽孢杆菌，可以显著提高宿主肠道内消化酶的活性，增加肠道中有益菌群（如双歧杆菌和乳杆菌）的数量。芽孢杆菌的种类繁多、功能各异，是目前在水产养殖中应用最普遍，使用数量最多的菌种，其研究与发展前景十分广阔。 

　　本试验对从不同种市售芽孢杆菌产品中提取分离得到的7株芽孢杆菌进行分类筛选，发现芽孢杆菌C24在基本培养基和高盐的培养基中均能旺盛生长，分泌胞外酶，对氨氮的降解率均达到75%以上，并且同时具有降低亚硝态氮的能力，说明其生长速度快，有一定的抗逆性，能有效去除水中氨氮，可作为高效氨氮降解的水产试验菌种。C22作为试验中唯一的厌氧菌，生长速度缓慢，菌液浓度偏低，所表现出的酶活力、抑菌能力也较差，但在亚硝酸氮的降解试验中，对亚硝酸氮的降解率明显高于其他菌种，达到64.4%，可作为有效去除亚硝态氮的水产试验菌种。C12和C13生长迅速，产蛋白酶、淀粉酶能力较强，可作为水体有机质降解的水产试验菌株。本次试验中得到的芽孢杆菌，虽然在去除氨氮，亚硝酸氮和有机物的降解等方面作用具有可行性，但其在应用实际生产中的降氨效果与有机物分解效率还需进一步研究。 

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