抗逆转基因旱稻转化体系的优化
2022-06-09
【论文摘要】以粳糯型常规旱稻品种“冀旱糯3号”为受体材料，利用农杆菌转化法将bar基因和lea-1基因转入旱稻细胞，建立了适用于旱稻的高效转化体系，最终获得转基因植株，并对转基因植株进行PCR检测。结果表明：当农杆菌浓度（以D600nm表示）为0.2时，转化效果最好。在筛选抗性愈伤时，除草剂的最佳浓度为40mg/L，对抗性愈伤组织进行预分化能提高其分化率，对转基因植株进行分子检测，优化后的转化率提高到37.5%。
【论文关键词】旱稻；除草剂；农杆菌；PCR；lea基因
1材料和方法
1.1旱稻材料
供式材料为粳糯型常规旱稻品种冀旱糯3号种子。
1.2基因
lea-1基因载体结构如图1所示。农杆菌菌株Agl-1，转化载体为pCAMBIA3301，其中含有小立碗藓胚胎晚期丰富蛋白LEA（Lateembryogenesisabundantprotein）基因，basta抗性基因，由中国农业科学院生物技术研究所路铁钢老师惠赠。
1.3培养基
1.3.1细菌培养基YEB：5g/L牛肉浸膏+1g/L酵母膏+5g/L蛋白胨+5g/L氯化钠，pH值7.4。AAM：AAM大量+AAM微量+MS有机+铁盐+肌醇+0.3g/L水解酪蛋白+68.5g/L蔗糖+36g/L葡萄糖，pH值5.2。
1.3.2愈伤组织诱导培养基/愈伤组织继代培养基N6大量+B5微量+B5有机+麦芽糖3%+肌醇+水解酪蛋白0.3g/L+精氨酸0.174g/L+天冬氨酸0.266g/L+谷氨酰胺0.876g/L+2，4-D2mg/L+凝胶0.58%，pH值5.8。
1.3.3农杆菌共培养培养基N6大量+B5微量+B5有机+铁盐+2，4-D+肌醇+水解酪蛋白0.3g/L+蔗糖30g+葡萄糖10g+AS20mg/L，pH值5.2。
1.3.4恢复培养基N6大量+B5微量+B5有机+蔗糖3%+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸0.5g/L+特美汀500mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.5抗性愈伤筛选培养基N6大量+B5微量+B5有机+蔗糖3%+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸0.5g/L+特美汀300mg/L+草铵膦30mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.6抗性愈伤预分化培养基N6大量+MS微量+B5有机+NAA1mg/L+6-BA3mg/L+ABA3mg/L+蔗糖3%+铁盐+水解酪蛋白0.5g/L+肌醇+特美汀300mg/L+草铵膦30mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.7抗性愈伤分化培养基N6大量+B5微量+B5有机+6-BA1mg/L+NAA1mg/L+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3g/L+蔗糖3%+植物凝胶，pH值5.8。
1.3.8生根壮苗培养基1/2MS+蔗糖3%+NAA0.5mg/L+植物凝胶0.28%，pH值5.8。
1.4旱稻愈伤组织培养
在无菌条件下，用75%乙醇浸泡已脱壳种子2min，用蒸馏水洗涤3次，30%NaClO浸泡40min，冀旱糯3号种子较其他旱稻种子相比更易染菌，所以浸泡过程中应不断摇晃锥形瓶，浸泡后用蒸馏水洗涤3次，重复1次；用无菌滤纸吸干种子表面水分，无菌条件下接种到诱导培养基上，在28℃黑暗条件下诱导愈伤组织；培养7d待少量愈伤长出后，进行切芽，切芽后接种于诱导培养基中，培养20d后挑选致密、状态佳的愈伤组织进行继代培养。
1.5农杆菌介导法转化水稻
1.5.1农杆菌的培养将Agl-1农杆菌菌种（含有lea及bar基因）涂布于固体YEP培养基（含有50mg/L硫酸卡那霉素和50mg/L利福平）的培养皿中，28℃过夜暗培养3d，从培养皿上刮取适量长出的农杆菌悬浮于液体AAM培养基中（内含终浓度为60mg/L的乙酰丁香酮）以备转化之用。
1.5.2农杆菌转化为了确定转化侵染时合适的菌液浓度，需要比较不同浓度菌液对愈伤转化效率的影响，挑选生长旺盛的愈伤组织，分别放入600nm处吸光度为0.1、0.2、0.3的AAM菌悬液中浸染，不断轻轻振摇20min后，倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上吸干。用小勺将表面干燥的愈伤均匀撒在铺有1张无菌滤纸的共培养培养基上，25℃暗培养3d后转移至恢复培养基，恢复培养基中不含筛选剂，主要作用是抑制农杆菌的生长。
1.6筛选
愈伤组织在恢复培养基中生长5d后转入筛选培养基中，为了确定转化筛选时合适的除草剂浓度，需要比较不同浓度除草剂对水稻愈伤生长的影响，将经过转化的淡黄色、干爽且呈颗粒状的愈伤组织分别转入含20、40、60mg/L草铵膦的培养基中，各培养基中接10板愈伤组织，28℃暗培养15d后，观察记录愈伤组织的生长、褐化、死亡情况。
1.7抗性愈伤组织获得、分化、幼苗生根及移栽
将愈伤组织转接于筛选培养基筛选2轮，每轮15d。挑选出浅色抗性愈伤组织接到预分化培养基上，28℃暗培养5～7d，直到抗性愈伤组织变白。将变白的抗性愈伤组织转入分化培养基上，28℃下光照培养30d左右，待其出现绿点；当绿点分化成3cm左右的芽时，将芽转接于生根培养基，25℃光照培养3周左右，最后将苗移栽至大田。
1.8抗性植株的分子检测
按Edwards等的方法[9]提取待测的叶片总DNA。引物设计：遵循引物设计原则，利用DNAMAN软件设计PCR检测引物，引物序列如下：F：5′-AATTTCTTTCTTTTTGGATTA3′，R：5′-TGCGGTGTCTTATTTACTAT3′。PCR反应体系（20μL）：DNA2μL，dNTPMix1μL，10×PCRbuffer2μL，Taq酶0.2μL，P11μL，P21μL，补水至20μL。PCR反应程序：96℃3min；94℃30s，58℃40s，72℃50s，35个循环；72℃10min。
1.9数据处理
对转基因植株PCR结果进行分析，统计基因的转化情况。转化率各指标的统计参照文献[10]。绿苗分化率=分化绿苗数/感染愈伤组织数×100%；假阳性率=（绿苗数-PCR阳性植株数）/绿苗数×100%；转化率=PCR阳性植株株数/感染愈伤组织数×100%。
2结果与分析
2.1愈伤组织的诱导
本研究得出，不含脯氨酸的NB培养基比水稻常用的MS培养基效果更好，将常用碳源蔗糖改为麦芽糖更有利于诱导旱稻愈伤组织。在培养基中添加2mg/L2，4-D，能使愈伤生长为最适宜转化的粟粒大小，接种7d后进行切芽，否则产生的大量根会影响愈伤组织的生长。20d后待愈伤长至图2的状态时进行继代。
【论文关键词】旱稻；除草剂；农杆菌；PCR；lea基因
1材料和方法
1.1旱稻材料
供式材料为粳糯型常规旱稻品种冀旱糯3号种子。
1.2基因
lea-1基因载体结构如图1所示。农杆菌菌株Agl-1，转化载体为pCAMBIA3301，其中含有小立碗藓胚胎晚期丰富蛋白LEA（Lateembryogenesisabundantprotein）基因，basta抗性基因，由中国农业科学院生物技术研究所路铁钢老师惠赠。
1.3培养基
1.3.1细菌培养基YEB：5g/L牛肉浸膏+1g/L酵母膏+5g/L蛋白胨+5g/L氯化钠，pH值7.4。AAM：AAM大量+AAM微量+MS有机+铁盐+肌醇+0.3g/L水解酪蛋白+68.5g/L蔗糖+36g/L葡萄糖，pH值5.2。
1.3.2愈伤组织诱导培养基/愈伤组织继代培养基N6大量+B5微量+B5有机+麦芽糖3%+肌醇+水解酪蛋白0.3g/L+精氨酸0.174g/L+天冬氨酸0.266g/L+谷氨酰胺0.876g/L+2，4-D2mg/L+凝胶0.58%，pH值5.8。
1.3.3农杆菌共培养培养基N6大量+B5微量+B5有机+铁盐+2，4-D+肌醇+水解酪蛋白0.3g/L+蔗糖30g+葡萄糖10g+AS20mg/L，pH值5.2。
1.3.4恢复培养基N6大量+B5微量+B5有机+蔗糖3%+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸0.5g/L+特美汀500mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.5抗性愈伤筛选培养基N6大量+B5微量+B5有机+蔗糖3%+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3g/L+脯氨酸0.5g/L+特美汀300mg/L+草铵膦30mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.6抗性愈伤预分化培养基N6大量+MS微量+B5有机+NAA1mg/L+6-BA3mg/L+ABA3mg/L+蔗糖3%+铁盐+水解酪蛋白0.5g/L+肌醇+特美汀300mg/L+草铵膦30mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.7抗性愈伤分化培养基N6大量+B5微量+B5有机+6-BA1mg/L+NAA1mg/L+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3g/L+蔗糖3%+植物凝胶，pH值5.8。
1.3.8生根壮苗培养基1/2MS+蔗糖3%+NAA0.5mg/L+植物凝胶0.28%，pH值5.8。
1.4旱稻愈伤组织培养
在无菌条件下，用75%乙醇浸泡已脱壳种子2min，用蒸馏水洗涤3次，30%NaClO浸泡40min，冀旱糯3号种子较其他旱稻种子相比更易染菌，所以浸泡过程中应不断摇晃锥形瓶，浸泡后用蒸馏水洗涤3次，重复1次；用无菌滤纸吸干种子表面水分，无菌条件下接种到诱导培养基上，在28℃黑暗条件下诱导愈伤组织；培养7d待少量愈伤长出后，进行切芽，切芽后接种于诱导培养基中，培养20d后挑选致密、状态佳的愈伤组织进行继代培养。
1.5农杆菌介导法转化水稻
1.5.1农杆菌的培养将Agl-1农杆菌菌种（含有lea及bar基因）涂布于固体YEP培养基（含有50mg/L硫酸卡那霉素和50mg/L利福平）的培养皿中，28℃过夜暗培养3d，从培养皿上刮取适量长出的农杆菌悬浮于液体AAM培养基中（内含终浓度为60mg/L的乙酰丁香酮）以备转化之用。
1.5.2农杆菌转化为了确定转化侵染时合适的菌液浓度，需要比较不同浓度菌液对愈伤转化效率的影响，挑选生长旺盛的愈伤组织，分别放入600nm处吸光度为0.1、0.2、0.3的AAM菌悬液中浸染，不断轻轻振摇20min后，倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上吸干。用小勺将表面干燥的愈伤均匀撒在铺有1张无菌滤纸的共培养培养基上，25℃暗培养3d后转移至恢复培养基，恢复培养基中不含筛选剂，主要作用是抑制农杆菌的生长。
1.6筛选
愈伤组织在恢复培养基中生长5d后转入筛选培养基中，为了确定转化筛选时合适的除草剂浓度，需要比较不同浓度除草剂对水稻愈伤生长的影响，将经过转化的淡黄色、干爽且呈颗粒状的愈伤组织分别转入含20、40、60mg/L草铵膦的培养基中，各培养基中接10板愈伤组织，28℃暗培养15d后，观察记录愈伤组织的生长、褐化、死亡情况。
1.7抗性愈伤组织获得、分化、幼苗生根及移栽
将愈伤组织转接于筛选培养基筛选2轮，每轮15d。挑选出浅色抗性愈伤组织接到预分化培养基上，28℃暗培养5～7d，直到抗性愈伤组织变白。将变白的抗性愈伤组织转入分化培养基上，28℃下光照培养30d左右，待其出现绿点；当绿点分化成3cm左右的芽时，将芽转接于生根培养基，25℃光照培养3周左右，最后将苗移栽至大田。
1.8抗性植株的分子检测
按Edwards等的方法[9]提取待测的叶片总DNA。引物设计：遵循引物设计原则，利用DNAMAN软件设计PCR检测引物，引物序列如下：F：5′-AATTTCTTTCTTTTTGGATTA3′，R：5′-TGCGGTGTCTTATTTACTAT3′。PCR反应体系（20μL）：DNA2μL，dNTPMix1μL，10×PCRbuffer2μL，Taq酶0.2μL，P11μL，P21μL，补水至20μL。PCR反应程序：96℃3min；94℃30s，58℃40s，72℃50s，35个循环；72℃10min。
1.9数据处理
对转基因植株PCR结果进行分析，统计基因的转化情况。转化率各指标的统计参照文献[10]。绿苗分化率=分化绿苗数/感染愈伤组织数×100%；假阳性率=（绿苗数-PCR阳性植株数）/绿苗数×100%；转化率=PCR阳性植株株数/感染愈伤组织数×100%。
2结果与分析
2.1愈伤组织的诱导
本研究得出，不含脯氨酸的NB培养基比水稻常用的MS培养基效果更好，将常用碳源蔗糖改为麦芽糖更有利于诱导旱稻愈伤组织。在培养基中添加2mg/L2，4-D，能使愈伤生长为最适宜转化的粟粒大小，接种7d后进行切芽，否则产生的大量根会影响愈伤组织的生长。20d后待愈伤长至图2的状态时进行继代。