抗稻瘟病链霉菌JK—1基因组BAC文库构建
2022-06-09
摘 要：实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3 456个克隆，插入片段在40～100kb，平均插入片段55kb，空载率低于5%，覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建，为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。
关键词：链霉菌；BAC文库；基因组
中图分类号 S435.111 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）24-17-03
Construction of the Bacterial Artificial Chromosome Library of Streptomyces JK-1 Resistance to Magnaporthe oryzae
Zhang Xuejiang et al.
（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Diseases，Insect Pests and Weeds Control，Wuhan 430064，China）
Abstract：A genomic bacterial artificial chromosome（BAC）library was constructed using nuclear DNA of Streptomyces JK-1 resistance to Magnaporthe oryzae. The library collected 3 456 recombinant clones carrying inserts with sizes ranging from 40kb to 100kb. The average insert size was about 55kb with empty-vector rate less than 5%. This BAC library represented 17.3 equivalents of Streptomyces genome. The BAC library will help further genome and fucntional gene research.
Key words：Streptomyces；BAC library；Genome
放线菌聚酮合酶基因（polyketide synthase genes，PKSs）合成的聚酮化合物具有广谱生物活性，表现出抗细菌、抗真菌、抗癌、治疗心血管疾病、降低胆固醇等效果[1]。放线菌中最重要的成员链霉菌，其产生的聚酮化合物占人类医用抗生素的60%以上[2]。在过去的几十年里，许多聚酮生物合成途径中的重要基因已被克隆并被异源表达[3-5]。
近年来，本实验室从蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）中分离到一株内生链霉菌JK-1，其次生代谢产物经平板生测实验表明，对稻瘟病菌的抑制率达99%以上。次生代谢产物经质谱分析表明，活性物质属于七烯类化合物，该化合物在化学结构数据库中没有相应的结构，属于一种全新的聚酮化合物。因此本项目试图将本实验室发现的这株链霉菌JK-1基因组中的多烯类聚酮合成酶基因/簇通过构建基因组BAC（Bacterial artificial chromosome）文库的方法克隆出来，并进行生物信息学分析和功能预测，为抗水稻稻瘟病提供新的抗性基因。
1 材料与方法
1.1 实验材料 链霉菌JK-1由本实验室保存，该菌自蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）（于2008年采自中国科学院武汉植物园）内分离得到，其孢子的甘油悬浮液于-80℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 BAC载体的制备 克隆载体pHZAUBAC1[6]由华中农业大学罗美中教授惠赠。pHZAUBAC1质粒采用Qiagen plasmid midi kit提取，用BamHI（NEB）酶切，再用CIAP（NEB）酶脱磷酸化并进行自连反应，用脉冲电泳分离目的DNA片段pIndigoBAC36-S，用电洗脱法回收估测浓度，根据DNA的浓度加入甘油调整终浓度至25ng/μL，分装后于-80℃保存。
1.2.2 高分子量基因组DNA BamHI部分酶切产物的制备 链霉菌JK-1高纯度大分子量基因组DNA凝胶块（plug）的制备参照王万群的实验方法[7]。将制备好的plug做BamHI部分酶切，确定能产生50～150kb范围片段的内切酶用量。设0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8共6个不同用量的BamHI酶浓度梯度，3/8的plug，冰上轻摇2h，然后30℃酶切10min。对酶切产物进行脉冲场凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间0.1～40s，运行16h。根据电泳结果，确定最适内切酶用量。然后做大量酶切，经2次脉冲场电泳、电洗脱法分离纯化50～100kb和100～150kb间的DNA片段的凝胶块，用λDNA来定量所回收大片段DNA的浓度。
关键词：链霉菌；BAC文库；基因组
中图分类号 S435.111 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）24-17-03
Construction of the Bacterial Artificial Chromosome Library of Streptomyces JK-1 Resistance to Magnaporthe oryzae
Zhang Xuejiang et al.
（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Diseases，Insect Pests and Weeds Control，Wuhan 430064，China）
Abstract：A genomic bacterial artificial chromosome（BAC）library was constructed using nuclear DNA of Streptomyces JK-1 resistance to Magnaporthe oryzae. The library collected 3 456 recombinant clones carrying inserts with sizes ranging from 40kb to 100kb. The average insert size was about 55kb with empty-vector rate less than 5%. This BAC library represented 17.3 equivalents of Streptomyces genome. The BAC library will help further genome and fucntional gene research.
Key words：Streptomyces；BAC library；Genome
放线菌聚酮合酶基因（polyketide synthase genes，PKSs）合成的聚酮化合物具有广谱生物活性，表现出抗细菌、抗真菌、抗癌、治疗心血管疾病、降低胆固醇等效果[1]。放线菌中最重要的成员链霉菌，其产生的聚酮化合物占人类医用抗生素的60%以上[2]。在过去的几十年里，许多聚酮生物合成途径中的重要基因已被克隆并被异源表达[3-5]。
近年来，本实验室从蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）中分离到一株内生链霉菌JK-1，其次生代谢产物经平板生测实验表明，对稻瘟病菌的抑制率达99%以上。次生代谢产物经质谱分析表明，活性物质属于七烯类化合物，该化合物在化学结构数据库中没有相应的结构，属于一种全新的聚酮化合物。因此本项目试图将本实验室发现的这株链霉菌JK-1基因组中的多烯类聚酮合成酶基因/簇通过构建基因组BAC（Bacterial artificial chromosome）文库的方法克隆出来，并进行生物信息学分析和功能预测，为抗水稻稻瘟病提供新的抗性基因。
1 材料与方法
1.1 实验材料 链霉菌JK-1由本实验室保存，该菌自蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）（于2008年采自中国科学院武汉植物园）内分离得到，其孢子的甘油悬浮液于-80℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 BAC载体的制备 克隆载体pHZAUBAC1[6]由华中农业大学罗美中教授惠赠。pHZAUBAC1质粒采用Qiagen plasmid midi kit提取，用BamHI（NEB）酶切，再用CIAP（NEB）酶脱磷酸化并进行自连反应，用脉冲电泳分离目的DNA片段pIndigoBAC36-S，用电洗脱法回收估测浓度，根据DNA的浓度加入甘油调整终浓度至25ng/μL，分装后于-80℃保存。
1.2.2 高分子量基因组DNA BamHI部分酶切产物的制备 链霉菌JK-1高纯度大分子量基因组DNA凝胶块（plug）的制备参照王万群的实验方法[7]。将制备好的plug做BamHI部分酶切，确定能产生50～150kb范围片段的内切酶用量。设0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8共6个不同用量的BamHI酶浓度梯度，3/8的plug，冰上轻摇2h，然后30℃酶切10min。对酶切产物进行脉冲场凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间0.1～40s，运行16h。根据电泳结果，确定最适内切酶用量。然后做大量酶切，经2次脉冲场电泳、电洗脱法分离纯化50～100kb和100～150kb间的DNA片段的凝胶块，用λDNA来定量所回收大片段DNA的浓度。