新型产琼胶酶海洋细菌的筛选和鉴定
2022-06-09
摘要：从大连沿海的50份石花菜中筛选出相对酶活较高的83株产琼胶酶菌株（酶活力测定采用3， 5 - 二硝基水杨酸法），挑选琼胶酶活力最高的菌株并通过形态学特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析研究其分类地位。结果表明，该菌株（暂命名为ZGR-26）为革兰氏阴性杆菌，与食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）序列同源性达到99%，两者生理生化特性基本相符，可初步确定为食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）。筛选得到了新型的产琼胶酶海洋细菌——食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans），分泌琼胶酶活力较高（32.1 U/mL），为微生物降解法生产琼胶寡糖提供了新的出发菌株。
关键词：琼胶酶;筛选与鉴定;16S rRNA;食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4831-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.015
Screening and Identification of A Novel Marine Bacterium Producing Agarase
LIU Li-li， ZU Guo-ren
（ School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China）
Abstract： 83 agarase-producing strain with high enzyme activity were screened from 50 samples of Gelidium in Dalian coast by DNS method. The morphology， physiological characteristics and 16SrRNA sequence of the strains were identified to characterize its classification status. The results showed that the strain （named as ZGR-26） was Gram negative bacilli， had 99% homology and consistent physiological and biochemical characteristics with Vibrio agarivorans. The screened novel marine agarase-producing bacteria was identified as Vibrio agarivorans. The activity of producing agarase reached to 32.1 U/mL. It will provide a initial strain to agar- oligosaccharides manufacture by bio-degradation.
Key words： agarse; screening and identification;16SrRNA;Vibrio agarivorans
琼脂又称琼胶，是一组海藻多糖的总称，由半乳糖和3，6—内醚—L-半乳糖通过1—3和1—4糖苷键交替连接的长链，在C6上被硫酸酯化，是一类含硫酸酯的半乳聚糖[1]。天然琼胶是一种从海洋藻类细胞壁中提取出来的多糖，其水解产物琼胶低聚糖或琼胶寡糖在食品和医药领域应用广泛。琼胶寡糖不受肠道内细菌分解以及无热量产生，因而可作高甜味剂的填充剂及分散剂用于饮料、面包及低热量食品的生产[2]。琼胶寡糖通过阻止可诱导性NO合成酶（iNOS）的表达来抑制过量NO自由基的产生，从而消除一些因NO过量而造成的关节炎等炎症[3]。此外琼胶低聚糖ML对自由基有很好的清除作用，小鼠试验表明中分子琼胶低聚糖（ML）可保护抗氧化酶SOD和GSH—Px的活力，对肝损伤有良好的保护作用[4]。目前琼胶寡糖的获取途径主要是通过化学降解法和酶解法，化学降解法存在条件难控制、产物不均一、产物分析和回收难等问题。用微生物分泌的琼胶酶水解琼胶制备琼胶寡糖，不仅反应条件温和，能耗低，且酶催化具有高效性和专一性，选择性地切断糖苷键，可克服化学降解法存在的问题[5]。
目前绝大部分琼胶酶来源于海洋生态系统中的海洋细菌，这类微生物分布范围非常广且其产酶量大。刘江涛等[6]从江蓠中分离得到了两株多食鞘氨醇杆菌;田国强等[7]发现红藻门江蓠和石花菜中共生有Agarivorans、Cellulophaga、Alteromonas、Saccharophagus、Glaciecola、Vibrio 6个属的具有降解琼胶能力的海洋细菌;除了在海洋生态系统以外，降解琼胶的菌类也同样存在陆地生态系统中，Suzuki 等[8]在日本岐阜地区的土壤中分离到一株能够产生α-新琼寡糖水解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.MK03） 。论文发表这些已发现的海洋细菌降解琼胶能力普遍偏低，还远未能达到工业化生产琼胶寡糖的需求，这也成为阻碍生物法制备琼胶寡糖的瓶颈，本研究从海洋微生物中分离出高效降解琼胶的菌株，为今后开发利用海洋细菌细胞内的多糖降解酶和对应的功能基因生产功能性寡糖奠定基础;同时，为进一步研究凝胶的寡糖成分、寡糖活性创造条件。
1 材料与方法
1.1 材料
关键词：琼胶酶;筛选与鉴定;16S rRNA;食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4831-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.015
Screening and Identification of A Novel Marine Bacterium Producing Agarase
LIU Li-li， ZU Guo-ren
（ School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China）
Abstract： 83 agarase-producing strain with high enzyme activity were screened from 50 samples of Gelidium in Dalian coast by DNS method. The morphology， physiological characteristics and 16SrRNA sequence of the strains were identified to characterize its classification status. The results showed that the strain （named as ZGR-26） was Gram negative bacilli， had 99% homology and consistent physiological and biochemical characteristics with Vibrio agarivorans. The screened novel marine agarase-producing bacteria was identified as Vibrio agarivorans. The activity of producing agarase reached to 32.1 U/mL. It will provide a initial strain to agar- oligosaccharides manufacture by bio-degradation.
Key words： agarse; screening and identification;16SrRNA;Vibrio agarivorans
琼脂又称琼胶，是一组海藻多糖的总称，由半乳糖和3，6—内醚—L-半乳糖通过1—3和1—4糖苷键交替连接的长链，在C6上被硫酸酯化，是一类含硫酸酯的半乳聚糖[1]。天然琼胶是一种从海洋藻类细胞壁中提取出来的多糖，其水解产物琼胶低聚糖或琼胶寡糖在食品和医药领域应用广泛。琼胶寡糖不受肠道内细菌分解以及无热量产生，因而可作高甜味剂的填充剂及分散剂用于饮料、面包及低热量食品的生产[2]。琼胶寡糖通过阻止可诱导性NO合成酶（iNOS）的表达来抑制过量NO自由基的产生，从而消除一些因NO过量而造成的关节炎等炎症[3]。此外琼胶低聚糖ML对自由基有很好的清除作用，小鼠试验表明中分子琼胶低聚糖（ML）可保护抗氧化酶SOD和GSH—Px的活力，对肝损伤有良好的保护作用[4]。目前琼胶寡糖的获取途径主要是通过化学降解法和酶解法，化学降解法存在条件难控制、产物不均一、产物分析和回收难等问题。用微生物分泌的琼胶酶水解琼胶制备琼胶寡糖，不仅反应条件温和，能耗低，且酶催化具有高效性和专一性，选择性地切断糖苷键，可克服化学降解法存在的问题[5]。
目前绝大部分琼胶酶来源于海洋生态系统中的海洋细菌，这类微生物分布范围非常广且其产酶量大。刘江涛等[6]从江蓠中分离得到了两株多食鞘氨醇杆菌;田国强等[7]发现红藻门江蓠和石花菜中共生有Agarivorans、Cellulophaga、Alteromonas、Saccharophagus、Glaciecola、Vibrio 6个属的具有降解琼胶能力的海洋细菌;除了在海洋生态系统以外，降解琼胶的菌类也同样存在陆地生态系统中，Suzuki 等[8]在日本岐阜地区的土壤中分离到一株能够产生α-新琼寡糖水解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.MK03） 。论文发表这些已发现的海洋细菌降解琼胶能力普遍偏低，还远未能达到工业化生产琼胶寡糖的需求，这也成为阻碍生物法制备琼胶寡糖的瓶颈，本研究从海洋微生物中分离出高效降解琼胶的菌株，为今后开发利用海洋细菌细胞内的多糖降解酶和对应的功能基因生产功能性寡糖奠定基础;同时，为进一步研究凝胶的寡糖成分、寡糖活性创造条件。
1 材料与方法
1.1 材料