枸杞花中总多酚含量的测定
2022-06-09
摘要：以水和95%乙醇为提取剂，采用超声提取法提取宁夏枸杞 （Lycium barbarum L.） 花中的多酚类化合物。结果表明，水提取物和95%乙醇提取物中多酚类化合物分别含有60.75 mg和13.55 mg，总量为74.30 mg，约占干枸杞花的1.49%。
关键词：枸杞 （Lycium barbarum L.）；没食子酸；总多酚
中图分类号：O657.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4164-03
Determing the Total Polyphenol Content in Lycium barbarum Flowers
CHENG Liu-ke， BEI Zhan-lin， ZHANG Xin
（College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021， China）
Abstract： Using H2O and 95% ethanol solution as extractant， polyphenol compounds were extracted from the dry flowers power of flowers of Lycium barbarum L. in Ningxia with ultrasonic-wave method. The results showed that 60.75 mg and 13.55 mg of polyphenol compounds were obtained from the extractive by H2O and 95% ethanol， solution respectively， accounting for 1.49% of dry flower.
Key words： Lycium barbarum L. flower； gallic acid； total polyphenol
枸杞（Lycium barbarum L.）全身是宝，《本草纲目》记载，“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。枸杞花通常单生或二至数朵簇生于叶腋或短枝上紫色或淡紫色，花梗细，花期4～10月。对枸杞的药用成分及药用机理等相关研究已相当深入。
多酚是一大类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，其含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。狭义上认为植物多酚是单宁或鞣质；广义上还包括小分子酚类化合物，如花青素、儿茶素、栎精、没食子酸等[1，2]。目前植物多酚在很多方面都有深入研究[3-5]，例如，在农业生产（用于制螯合肥料），生态环境保护（用来降低废水中重金属毒害），食品工业（用作天然抗氧化剂），医药（具有抑菌、抗病毒、抗癌等作用）等方多面都有深入的研究，多酚类化合物具有很大的应用价值。对枸杞花方面，沈剑明等[6]研究了宁夏枸杞的花联合现象，刘兰英等[7]对枸杞花色素提取工艺进行了研究，贝盏临等[8，9]研究了枸杞花的抗氧化活性、作用以及其总黄酮的含量，其他有关枸杞花有效成分方面的研究尚未见报道。本研究对枸杞花的总多酚含量进行了相关研究，旨在为今后探索枸杞花的活性功能因子，为枸杞花的食用和开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料 新鲜的枸杞花于2012年8月采自宁夏中宁县康滩枸杞园，标本保存于北方民族大学生物科学系植物标本室。将新鲜枸杞花（宁杞1号）放置于阴凉处阴干，然后用粉碎机进行粉碎，粉碎后的粉末放入干净的密封塑料袋中保藏备用。
1.1.2 药品 没食子酸、Folin-Ciocalteu（1 mol/L）、碳酸钠、无水乙醇（99.5%），以上试剂均为分析纯，均购自北京化学试剂公司。
1.1.3 试验器材 FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、FA2104B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、KQ-500B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、减压蒸馏装置、ALPHA型冷冻干燥机（德国Marin Christ 公司）、4K15型离心机（Sigma公司）、UV765型紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 样品的制备
1）水提取物的制备。称取粉碎后的枸杞花5.0 g，置于250 mL锥形瓶，加入去离子水100 mL，用超声仪（40 kHz，50 ℃）超声提取50 min，得到的提取液经真空抽滤，得到澄清的提取液。残渣用去离子水洗涤，并在相同的条件下提取2～3次，收集提取液，合并，减压蒸馏得到浓缩液。
2）乙醇提取物的制备：向去离子水提取后的枸杞花残渣中加入60%的乙醇溶液，提取方法及步骤与去离子水提取方法相同。然后，再依次用85%和95%的乙醇对经60%乙醇提取后的残渣再次进行提取。合并以上60%、85%和95%乙醇提取液，对所得提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取液。将以上所得的乙醇提取液在-70 ℃下冷冻过夜。最后，用真空干燥机进行真空干燥，真空干燥时间为27 h，干燥结束后收集粉末状物质。向粉末状物体中加入95%乙醇溶液，得到可溶于95%乙醇溶液与不溶于95%乙醇溶液的沉淀。经10 000 r/min离心15 min后，得到上清液，上清液即为溶于95%乙醇溶液，记录最终体积，标记为样品95%乙醇提取物，4 ℃下保藏备用。离心得到的沉淀加入适量的去离子水，大部分溶于去离子水，再经10 000 r/min离心15 min，得到溶于去离子水的上清液，此上清液与去离子水提取物溶液合并到一起，并记录最终的总体积，标记为样品水提取物，在4 ℃下保藏备用。
1.2.2多酚类化合物的测定 多酚类化合物的测定方法参照[10-12]，略有改动。
1）最大吸收波长的确定：精确称取干燥至恒重的没食子酸5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用去离子水溶解，定容至刻度，摇匀，即得到0.05 mg/mL没食子酸标准溶液。精确吸取0.05 mg/mL没食子酸标准溶液2 mL，加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；充分混匀后，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。同时，以未加入没食子酸的溶液作为空白溶液，于紫外-可见分光光度计在400～900 nm下进行扫描。检测最大吸收峰，最大吸收峰为753 nm。
2）多酚类化合物标准曲线的绘制：精确吸取没食子酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，于已标记好0、1、2、3、4、5、6、7号的25 mL棕色容量瓶中；再依次加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；最后用去离子水定容到25 mL；充分混匀，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。以0号作对照，于753 nm处测定不同浓度的没食子酸对应的吸光值。其中，0-7号标准样最终得到的浓度为0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3组重复，取平均值，绘制标准曲线，并得出回归方程。
3）样品水提取物中多酚类化合物的测定：将样品水提取物稀释10倍；精确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液体于已标记好0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中。其余步骤同上。做3组重复，以0号作对照，于753 nm处测定吸光度。取平均值，记录各组数据，绘制出吸光度随样品水提取物体积变化的曲线。在曲线上找到样品水提取物稀释10倍，取1 mL样品所得到的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得出样品水提取物的多酚类化合物的含量。
关键词：枸杞 （Lycium barbarum L.）；没食子酸；总多酚
中图分类号：O657.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4164-03
Determing the Total Polyphenol Content in Lycium barbarum Flowers
CHENG Liu-ke， BEI Zhan-lin， ZHANG Xin
（College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021， China）
Abstract： Using H2O and 95% ethanol solution as extractant， polyphenol compounds were extracted from the dry flowers power of flowers of Lycium barbarum L. in Ningxia with ultrasonic-wave method. The results showed that 60.75 mg and 13.55 mg of polyphenol compounds were obtained from the extractive by H2O and 95% ethanol， solution respectively， accounting for 1.49% of dry flower.
Key words： Lycium barbarum L. flower； gallic acid； total polyphenol
枸杞（Lycium barbarum L.）全身是宝，《本草纲目》记载，“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。枸杞花通常单生或二至数朵簇生于叶腋或短枝上紫色或淡紫色，花梗细，花期4～10月。对枸杞的药用成分及药用机理等相关研究已相当深入。
多酚是一大类广泛存在于植物体内的次生代谢产物，其含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。狭义上认为植物多酚是单宁或鞣质；广义上还包括小分子酚类化合物，如花青素、儿茶素、栎精、没食子酸等[1，2]。目前植物多酚在很多方面都有深入研究[3-5]，例如，在农业生产（用于制螯合肥料），生态环境保护（用来降低废水中重金属毒害），食品工业（用作天然抗氧化剂），医药（具有抑菌、抗病毒、抗癌等作用）等方多面都有深入的研究，多酚类化合物具有很大的应用价值。对枸杞花方面，沈剑明等[6]研究了宁夏枸杞的花联合现象，刘兰英等[7]对枸杞花色素提取工艺进行了研究，贝盏临等[8，9]研究了枸杞花的抗氧化活性、作用以及其总黄酮的含量，其他有关枸杞花有效成分方面的研究尚未见报道。本研究对枸杞花的总多酚含量进行了相关研究，旨在为今后探索枸杞花的活性功能因子，为枸杞花的食用和开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料 新鲜的枸杞花于2012年8月采自宁夏中宁县康滩枸杞园，标本保存于北方民族大学生物科学系植物标本室。将新鲜枸杞花（宁杞1号）放置于阴凉处阴干，然后用粉碎机进行粉碎，粉碎后的粉末放入干净的密封塑料袋中保藏备用。
1.1.2 药品 没食子酸、Folin-Ciocalteu（1 mol/L）、碳酸钠、无水乙醇（99.5%），以上试剂均为分析纯，均购自北京化学试剂公司。
1.1.3 试验器材 FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、FA2104B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、KQ-500B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、减压蒸馏装置、ALPHA型冷冻干燥机（德国Marin Christ 公司）、4K15型离心机（Sigma公司）、UV765型紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 样品的制备
1）水提取物的制备。称取粉碎后的枸杞花5.0 g，置于250 mL锥形瓶，加入去离子水100 mL，用超声仪（40 kHz，50 ℃）超声提取50 min，得到的提取液经真空抽滤，得到澄清的提取液。残渣用去离子水洗涤，并在相同的条件下提取2～3次，收集提取液，合并，减压蒸馏得到浓缩液。
2）乙醇提取物的制备：向去离子水提取后的枸杞花残渣中加入60%的乙醇溶液，提取方法及步骤与去离子水提取方法相同。然后，再依次用85%和95%的乙醇对经60%乙醇提取后的残渣再次进行提取。合并以上60%、85%和95%乙醇提取液，对所得提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取液。将以上所得的乙醇提取液在-70 ℃下冷冻过夜。最后，用真空干燥机进行真空干燥，真空干燥时间为27 h，干燥结束后收集粉末状物质。向粉末状物体中加入95%乙醇溶液，得到可溶于95%乙醇溶液与不溶于95%乙醇溶液的沉淀。经10 000 r/min离心15 min后，得到上清液，上清液即为溶于95%乙醇溶液，记录最终体积，标记为样品95%乙醇提取物，4 ℃下保藏备用。离心得到的沉淀加入适量的去离子水，大部分溶于去离子水，再经10 000 r/min离心15 min，得到溶于去离子水的上清液，此上清液与去离子水提取物溶液合并到一起，并记录最终的总体积，标记为样品水提取物，在4 ℃下保藏备用。
1.2.2多酚类化合物的测定 多酚类化合物的测定方法参照[10-12]，略有改动。
1）最大吸收波长的确定：精确称取干燥至恒重的没食子酸5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用去离子水溶解，定容至刻度，摇匀，即得到0.05 mg/mL没食子酸标准溶液。精确吸取0.05 mg/mL没食子酸标准溶液2 mL，加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；充分混匀后，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。同时，以未加入没食子酸的溶液作为空白溶液，于紫外-可见分光光度计在400～900 nm下进行扫描。检测最大吸收峰，最大吸收峰为753 nm。
2）多酚类化合物标准曲线的绘制：精确吸取没食子酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，于已标记好0、1、2、3、4、5、6、7号的25 mL棕色容量瓶中；再依次加入Folin-Ciocalteu试剂1 mL和7.5%碳酸钠溶液8 mL；最后用去离子水定容到25 mL；充分混匀，在50 ℃水浴下保持10 min；迅速冷却。以0号作对照，于753 nm处测定不同浓度的没食子酸对应的吸光值。其中，0-7号标准样最终得到的浓度为0.000、0.001、0.002、0.003、0.005、0.006、0.007 mg/mL。做3组重复，取平均值，绘制标准曲线，并得出回归方程。
3）样品水提取物中多酚类化合物的测定：将样品水提取物稀释10倍；精确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL液体于已标记好0、1、2、3、4、5、6号的25 mL棕色容量瓶中。其余步骤同上。做3组重复，以0号作对照，于753 nm处测定吸光度。取平均值，记录各组数据，绘制出吸光度随样品水提取物体积变化的曲线。在曲线上找到样品水提取物稀释10倍，取1 mL样品所得到的吸光度值，根据标准曲线得到相对应的没食子酸的浓度，进而得出样品水提取物的多酚类化合物的含量。