天兰草茎、叶、果粗提物中马缨丹烯A含量测定与抗菌活性研究

摘要：从天兰草（Lantana camara L.）分离纯化得到马缨丹烯A（Lantadene A，LA），通过1H NMR谱对其结构进行了鉴定。以LA为标准品，采用紫外分光光度法测定了天兰草茎、叶和果中LA的含量。结果表明，天兰草茎、叶和果干粉中LA含量分别为1.49、3.43和2.74 mg/g。纸片琼脂扩散法抗菌试验结果表明，天兰草茎、叶和果粗提物均对金黄色葡萄球菌表现出一定程度的抑菌活性，其抑菌活性与LA含量呈正比关系。

　　关键词：天兰草（Lantana camara L.）；马缨丹烯A；含量测定；紫外分光光度法；抗菌活性

　　中图分类号：Q949.95，S58 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1657-03

　　Determination of Lantadene A and Antibacterial Activity of the Crude Extracts of the Stems，Leaves and Fruits of Lantana camara L.

　　ZHU Fenga，LU Wei-hongb，HUANG Mei-zhena，WU Jing-shua，CHEN Xina

　　（Foshan University， a.Department of Chemistry and Chemical Engineering；

　　b.School of Life Science，Foshan 528231，Guangdong， China ）

　　Abstract：Pure lantadene A（LA） was isolated from the leaves of Lantana camara L.， and its structure was identified by 1H NMR. The content of LA in the stem， leave and fruit were determined by ultraviolet spectrophotometry with LA as standard sample. The contents of LA in the stem， leave and fruit of Lantana camara L. were 1.49，3.43 and 2.74 mg/g， respectively. In the antibacterial assay by agar diffusion method， the crude extracts of the stem， leave and fruit of Lantana camara L. showed moderate activity against staphylococcus aureus. The results indicated that the antibacterial activity was positively correlated with the content of LA in the crude extracts of the stem， leave and fruit of Lantana camara L.

　　Key words： Lantana camara L.； lantadene A； content determination； ultraviolet spectrophotometry； antibacterial activity

　　长期以来，抗生素作为临床用药在治疗人类的疾病中起着重要作用，但抗生素的滥用导致的病原菌的耐药性以及新病原菌的泛滥，已被认为是威胁人类健康的全球性问题。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人类的一种重要病原菌，已产生了耐药性，新出现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）被称为超级细菌，几乎能抵抗人类现在所有的药物，现在仅有万古霉素对它有效。因此，人类迫切需要从自然界中寻找到具有特殊疗效的新药。

　　天兰草（Lantana camara L.）学名五色梅，马鞭草科马缨丹属，是一种生长于热带和亚热带的灌木，又名臭草，原产美洲热带，我国南北都有引种栽培，以广东、福建、台湾、浙江、云南、四川等省区为多，华南地区的荒郊野外多有大片野生分布，其根、茎、叶、花可作药用，具有清热解毒、散解止痛、祛风止痒之功效，能治感冒高热、久热不退、痢疾、肺结核、哮喘性支气管扩张、高血压等病症。茎叶煎汤洗治湿疹、疥癞毒疮、皮炎、皮肤痒、臃肿，捣烂敷患处能治跌打筋伤[1]。学者们研究了其不同部位粗提物的驱虫、杀虫活性[2-5]、植物化感和除草作用[6-9]、镇静和镇痛作用[10-14]、抗类风湿作用[15，16]、抗菌活性[17，18]和细胞毒性[19]等。据报道，反刍动物误食其叶可引起胆汁郁积和肝中毒，研究表明引起肝中毒的毒素是五环三萜类化合物，通称为马缨丹烯[20]。早在1983年，Sharma等[21]便建立了一种可见分光光度法用于测定五色梅叶中马缨丹烯A（LA）的含量，1991年Sharma等[22]比较了不同品种马缨丹属植物中马缨丹烯的含量，1997年，Sharma等 [23]又通过RP-HPLC法分析了五色梅叶中各种马缨丹烯，并于2000年比较了五色梅嫩叶和老叶中马缨丹烯的含量[24]。

　　本研究首次通过紫外分光光度法测定了天兰草不同部位（茎、叶和果）中LA的含量，并评价了其茎、叶和果粗提物抑制金黄色葡萄球菌的活性，初步探讨了粗提物中LA含量与其抗菌活性的量效关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要仪器 AVANCE AV 400型超导核磁共振谱仪（瑞士BRUKER公司），UV-2501PC型紫外-可见吸收光谱仪（日本岛津公司）。

　　1.1.2 材料 天兰草茎、叶和果样品于2012年12月采集于佛山科学技术学院北院校区，根据文献[1]鉴定为Lantana camara L.。新鲜天兰草茎、叶和果用去离子水洗净、风干、粉碎，备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 天兰草粗提物的制备 准确称取10 g茎干燥样品粉末，用200 mL甲醇室温浸泡，提取3次，每次24 h。甲醇提取液合并，加5 g活性炭于室温下搅拌脱色，抽滤得甲醇提取液。甲醇提取液于50 ℃真空旋转蒸发得到甲醇粗提物浸膏，浸膏悬浮于50 mL甲醇-水溶液（1∶7，V/V）中，等体积氯仿萃取3次，氯仿萃取液合并，于50 ℃真空旋转蒸发得天兰草茎粗提物，保存于450 ℃冰箱备用。叶和果粗提物按同法制备。

　　1.2.2 LA的纯化[25]与鉴定 另取100 g天兰草叶干燥粉末按“1.2.1”方法得到叶粗提物，叶粗提物溶于适量甲醇，置于低温冰箱中过夜，析出大量白色晶体。白色晶体过硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗脱，收集最大洗脱组分，减压浓缩后得白色固体，白色固体溶于微量甲醇，通过硅胶制备薄层层析进一步纯化（展开剂：己烷-甲醇-乙酸乙酯（85∶10∶5，V/V/V）），甲醇重结晶2次，50 ℃真空干燥至恒重，得到LA。

　　LA：m.p.273～275 ℃，1H NMR（CDCl3） δ：5.97（1H，dd，J=7.0，1.5 Hz），5.37（1H，br s），5.05（1H，brs），3.00（1H，dd，J=12.6，3.8Hz），1.17，1.06，1.02，1.00，

　　0.97，0.86，0.81（7×CH3），1.94（3H，dd，J= 7.0，1.4 Hz CH3），1.96（3H，s，CH3）。与文献[26，27]的报道基本一致。

　　1.2.3 测定波长的确定 精密称取“1.2.2”项所得LA 20 mg，用无水甲醇溶解，定容至20 mL，得1 mg/mL LA标准溶液。精密移取标准溶液1 mL，用无水甲醇定容至10 mL，以无水甲醇为空白对照，以200～600 nm进行全波长扫描，测得最大吸收波长为230 nm，因此以230 nm为测定波长。

　　1.2.4 标准曲线的绘制 将“1.2.2”项所得LA标准溶液用无水甲醇配制成0～500 μg/mL系列浓度溶液（浓度梯度50 μg/mL），以无水甲醇为空白对照，于230 nm测其吸光度（A），以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到线性回归方程：A=0.043 79+0.011 84 C，R2=0.996 81。

　　1.2.5 LA含量测定 按“1.2.1”法制备的天兰草茎、叶和果粗提物分别用无水甲醇溶解并定容至100 mL，以无水甲醇为空白对照，分别于230 nm测其吸光度，根据线性回归方程计算LA浓度，并计算样品中LA含量。

　　1.2.6 回收率试验 采用标注加入法。精密移取“1.2.2”项LA标准溶液1 mL和“1.2.1”项天兰草茎粗提物的甲醇溶液5 mL，用无水甲醇定容至10 mL，按“1.2.5”法测定其吸光度并计算回收率，重复5次。叶和果按同样操作进行。

　　1.2.7 抑菌活性试验 采用纸片扩散法[28-30]， 将试验微生物金黄色葡萄球菌用无菌生理盐水配置成为0.5麦氏单位的悬液， 接种于M-H琼脂平皿上， 分别贴上天兰草茎、叶和果粗提物药敏纸片，于35 ℃孵育24 h， 测定抑菌圈大小。含1 mL天兰草茎、叶和果粗提物的甲醇溶液的药敏纸片预先于50 ℃真空干燥挥发掉溶剂甲醇。

　　2 结果与分析

　　从天兰草叶中分离纯化得到的化合物LA的1H NMR谱在高场处除有9个未耦合的甲基信号外，还有类似甾体的多个氢信号，说明该化合物具有多环骨架，其氢谱数据与参考文献[26，27]中马缨丹烯A的氢谱数据对比一致，从而鉴定该化合物为马缨丹烯A，结构式见图1。

　　在相同条件下，通过紫外分光光度法分别测定了天兰草茎、叶和果粗提物甲醇溶液中LA的浓度，结果见表1，换算成生药干粉含量则分别为1.49、3.43和2.74 mg/g。结果表明，天兰草叶中LA含量最高，果含量其次，茎含量最少。采用添加法进行回收率试验，结果茎、叶和果中LA的平均回收率分别为96.02%、95.65%和95.82%，RSD分别为0.76%、0.86%和0.80%。表明本方法简便易行、灵敏度高、重现性好。

　　采用纸片扩散法测定了天兰草茎、叶和果粗提物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。蘸有粗提物溶液的药敏纸片于50 ℃真空干燥挥发掉溶剂甲醇，避免溶剂对结果的影响。抑菌试验结果见表1。试验结果显示叶粗提物抑菌活性最强，果其次，茎最弱。抑菌活性与样品中LA含量呈正比关系，提示LA可能是粗提物具有抑菌活性的主要原因。