精子形态分析标准化研究进展

　　精子形态作为评估男性生育潜能的指标始于20世纪初，从那时起用何种形式评估正常或异常精子一直是一个持续争论的领域。精子形态学分析体系是随着染色技术的发展和畸形精子分类体系的形成而建立的。有研究认为精子形态是衡量男性生育力的最好指标[1]。正常精子形态率下降是睾丸生理机能不良的一种反应，任何精子形态上的缺陷都将导致其功能下降，影响男性生育力[2]。但精子形态分析本身存在许多不足，如分析标准各异、染色方法不同、检测人员的主观性、检测分析未能标准化等[3]，造成实验室内部和不同实验室间的分析结果具有广泛的差异性，从而导致分析结果的不准确和不可信。因此，精子形态分析需要建立完善的检测技术体系和相应的质量控制体系。近年来，不少男科专家对精子形态学分析进行了标准化研究[4-6]。本文对国内外有关精子形态分析方法与质量控制体系研究进展进行综述。

　　1精子形态分析的标准化

　　1.1精子形态分析涂片的制备方法

　　涂片制备有两种方法，一种方法是取精液直接涂片，另一种是将精液洗涤离心去除精浆后涂片。精液洗涤后涂片是用CASA进行精子形态分析时普遍使用的方法[7]。因其染色后背景着色较浅，精子分散度好，更有利于形态分析。对于黏稠或液化不良的精液，通过吸管机械吹打、洗涤去除精浆后，得到的涂片质量效果也较好。但有研究表明，洗涤时相对离心力的选择对精子形态有影响，高相对离心力增加精子头部空泡畸形[8]，可能的原因是离心时间和离心转速均能增加活性氧的生成。提示洗涤制备涂片时要选择适宜的离心力及离心时间。

　　1.2精子形态分析的染色方法

　　1.2.1未经染色法Oral等[9]研究认为，未经染色法仅适用于分析形态正常的精子。也有学者认为，这种方法误差很大，不能反映精液的质量和真实情况[10]。对于不染色的精子，很难观察到其细微结构上的缺陷，目前实验室已较少采用此方法。

　　1.2.2染色方法目前国内外用于精子形态分析的染色方法主要有巴氏染色法、Diff-Quik染色法、Giemsa染色法、Bryan-Leishmen染色法、Shorr染色法等。Gimesa染色易于区分白细胞类型，但不能对精子提供可靠的对照。Bryan-Leishmen染色法精子各部位染色清晰，易于区别白细胞与未成熟生精细胞，但该方法试剂制备复杂，染色步骤繁琐。WHO手册中推荐使用巴氏染色法和Diff-Quik染色法，巴氏染色法可能够较好地分辨精子形态和区分其他细胞，清晰染色精子各部包括细胞核、核仁及细胞质，使精子内部结构对比明显，应用此方法可以长期保存标本，但该方法步骤繁琐，耗时较长。Diff-Quik染色法适用于CASA分析，操作简单快速，但涂片背景着色较深，同时有可能会增大精子头部。研究表明，巴氏染色法和Diff-quik染色法的精子形态评估结果一致，对正常形态精子评估具有高度正相关性[11-12]。

　　近年来出现的染色玻片法，不需经过涂片和干燥等步骤。染色玻片上均匀分布着一定比例对细胞结构有特殊亲和性的染料（新亚甲蓝N和紫罗兰甲酚酯，比例为1∶2.1），将液化的精液直接滴于玻片上，作用几分钟即可完成染色步骤。而传统涂片和干燥方法有时会破坏细胞结构。染色玻片法操作时间短，精子轮廓清晰，非精子细胞成分易于判读，效果与巴氏染色法相似[13]。

　　1.3精子形态分析标准

　　Cary于1930年首次提出人类精子形态在其穿透宫颈黏液过程中起重要作用，这一报道揭开了精子形态学研究的序幕。严格的精子形态评估方法（Tygerberg标准）是1987年由Menkveld[14-15]提出并在1990年进行了详细描述。形态正常精子的定义依据的是来自性生活后子宫颈黏液或卵子透明带表面回收的精子得到的生物学证据，这些精子大部分表现出均一的形态，精子头部形态会发现一些微小的生物学变化，但认为这些变化是正常的。严格评估标准的一个重要方面是必须保持这些正常生物学变化的范围尽可能小，因而认为所谓“临界的”或“轻微异常的”头部形式均是异常的。

　　目前全世界承认的关于精子形态分析的金标准是WHO手册，该手册从第3版开始引进了评估精子形态的严格标准，第4版[16]则完全采用严格评估（Tygerberg）方法。随着WHO手册的不断修订，精子形态正常参考值也在发生显著变化：手册第1版为50%，到第3版为30%，第4版仅说明当正常形态精子百分率低于15%时体外受精率显著降低，没有给出正常参考值。目前，第5版[7]对可育人群的正常精子形态百分比使用第5百分位数，参考值修订为4%。

　　Keel[3]调查表明，WHO手册并没有被实验室普遍接受，各实验室间执行着不同的标准，使得一个实验室与另一个实验间结果难以进行比对。研究表明，对精子形态学的不同解释取决于实验室评估正常形态学所用的标准[17]。决定精子形态学分类差异的不是标本制样误差，而是主要取决于对正常和异常的判断标准[18]。

　　1.4精子形态分析的方法