黄连上清丸、护肝片及牛黄解毒丸对药物代谢酶CYP3A4活性的影响

　　【摘要】目的：观察黄连上清丸、护肝片、牛黄解毒丸对CYP3A4活性的影响。方法：利用体外肝微粒体培育体系，以咪达唑仑作为探针底物，研究黄连上清丸、护肝片、牛黄解毒丸对人肝微粒体细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）活性的影响。结果：与空白组对比，黄连上清丸、牛黄解毒丸对CYP3A4活性表现为诱导作用，护肝片对CYP3A4活性表现为抑制作用。结论：在与临床上经 CYP3A4代谢的药物联合应用时，应警惕黄连上清丸、护肝片、牛黄解毒丸潜在药物之间的相互作用。 

　　【关键词】黄连上清丸；护肝片；牛黄解毒丸；细胞色素 P450 3A4 

　　细胞色素P450酶是人体内的肝药酶，广泛分布于肝脏等器官。研究发现，有20多种同工酶与药物代谢相关性高，共同参与人体内300余种药物的代谢[1]。多种药物同时使用时，若其中药物是CYP3A4的诱导剂或抑制剂，则会显著影响合用中其他药物的代谢，也会对其他药物的疗效产生影响。研究表明，多种中药提取物对P450活性有一定影响，如银杏、五味子、白芷、羌活等甲醇提取物对CYP3A4有抑制作用[2-3]。利用体外实验预测药物在体内是否发生药物代谢性相互作用，是药物代谢研究的热点内容。研究黄连上清丸、护肝片、牛黄解毒丸对重组人肝微粒体细胞色素酶rCYP3A4的影响，结果如下。 

　　1仪器与材料 

　　11仪器MINI-10K微型离心机（常州朗越仪器制造有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；XH-C旋涡混合器（常州朗越仪器制造有限公司）；DW-86L386立式超低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；FE20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；LC3000高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司）。 

　　12材料人重组肝细胞微粒体CYP3A4（批号：M41013，SPIBIO产）；咪达唑仑注射液（批号：20140607，江苏恩华药业股份有限公司；1羟基咪达唑仑（批号：FN08081402，Cerilliant）；卡马西平（批号：100142-201105，中国食品药品检定研究院）；酮康唑（批号：SM0325YF13，上海源叶生物科技有限公司）；NADPH（批号：WO1028EA14，上海源叶生物科技有限公司）。黄连上清丸（批号：14060026，太极集团重庆桐君阁药厂有限公司）；牛黄解毒丸（批号：13012307，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂）；护肝片（批号：201405102，黑龙江葵花药业股份有限公司）。乙腈（批号：20141021，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇（批号：20140723，广东光华科技股份有限公司）；磷酸氢二钾（批号：20140701-2，广州化学试剂厂）；三羟甲基氨基甲烷（批号：TA0429CA14，上海源叶生物科技有限公司）；无水氯化镁（批号：20140412，天津市福晨化学试剂厂）；碳酸氢钠（批号：20140701-1，广州化学试剂厂）。 

　　2实验方法 

　　21溶液的配制 

　　211咪达唑仑的配制精密吸取咪达唑仑注射液360μl（相当于咪达唑仑18mg），置于5ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，得到浓度均为10mmol/l的储备液，置于4℃冰箱备用。精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加入纯化水定容至刻度，摇匀，得到浓度为100μmol/l的咪达唑仑溶液。 

　　2121-羟基咪达唑仑标准溶液的配制精密吸取100μl 1-羟基咪达唑仑于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1μg/ml的储备液，精密吸取1ml 100μl 1-羟基咪达唑仑储备液于10ml容量瓶中，甲醇定容制刻度，得到100ng/ml的储备液，置于冰箱4℃下保存待用。 

　　213卡马西平内标溶液的配制精密称取100mg卡马西平于10ml容量瓶中，用乙腈定容得到1mg/ml的卡马西平储备液，从储备液中精密吸取200μl到10ml容量瓶中，用乙腈定容得到浓度为200μg/ml的内标溶液，4℃下保存备用。 

　　214磷酸盐缓冲液（pH74）的配制 取磷酸二氢钾136g，加 01mol/l氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得PBS溶液。 

　　215阳性抑制剂酮康唑的配制精密称取酮康唑265mg于5ml容量瓶中，用PBS溶液（pH 74）溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为100mmol/l的储备液，置于4℃冰箱备用。 

　　216氯化镁溶液的配制精密称量475mg氯化镁于10ml容量瓶中，用PBS溶液（pH 74）充分溶解，定容摇匀，得到5000mmol/l的氯化镁溶液。 

　　217NADPH溶液的配制精密称量83mg的NADPH用PBS溶液（pH 74）稀释得到浓度为100mmol/l的NADPH，现用现配，4℃冰箱避光保存。 

　　218人重组肝细胞微粒体CYP3A4的配制精密吸取100μl人重组肝细胞微粒体 CYP3A4，置于1ml容量瓶，用PBS溶液（pH 74）配制成浓度为100pmol/l的溶液，置于-20℃冰箱中保存。 

　　22孵育体系与样品处理[4-5] 

　　221孵育体系肝微粒体体外孵育体系的总体积为200μl：20μlCYP3A4（终浓度为10pmol·l-1），20μl氯化镁（终浓度为500mmol·l-1），10μl咪达唑仑（终浓度为5μmol·l-1），剩余体积用PBS缓冲溶液（pH74）补充，37℃水浴中孵育5min后，加入20μl NADPH（终浓度为10mmol/l）启动反应，反应5min。 

　　222样品处理孵育结束后，马上向孵育体系中加入100μl冰乙腈（含内标物质-卡马西平2μg/ml）终止反应，涡旋混合1min，-20℃下放置10min，10000r/min高速离心10min，取上清液过滤，吸取20μl注入到HPLC仪中测定。 

　　23色谱条件[6]色谱柱：Kromasil C18（250mm×46mm，5μm）；流速：100ml/min；柱温：40℃；检测波长：230nm；流动相：100mmol/L醋酸铵缓冲液-甲醇（42∶58）；进样量：20μl。 

　　24分组与给药[7]体外孵化反应分为阳性对照组、阴性对照组和试药组。阴性对照组中加入磷酸盐缓冲液（pH74），阳性对照组中加入酮康唑溶液（00125、0025、005、01、05、1、10、50μmol/l）；试药组给予以磷酸盐缓冲液（pH74）稀释的不同浓度的中成药溶液。孵育体系总体积均为200μl，根据“22孵育体系与样品处理”项下进行反应并处理。将所有样品按“23色谱条件”项下进行测定，根据代谢产物1-羟基咪达唑仑的生成率可确定 CYP3A4 酶的相对活性（即试药组占阴性对照组生成率的百分比），计算半数抑制率（IC50）。 

　　25标准曲线的制备取6只EP管，加入1-羟基咪达唑仑储备液，使1-羟基咪达唑仑的终浓度分别为10、20、50、100、200、500、1000ng/ml，按照体外孵育和样品处理方法“22孵育体系与样品处理”项操作，取上清液20μl进样，以1-羟基咪达唑仑和卡马西平的峰面积比值（Y）和含量（X）进行加权回归。 

　　26酮康唑IC50的测定及抑制活性的评价在肝微粒体孵育体系中阳性抑制剂酮康唑对CYP3A4介导的咪达唑仑1-羟基化反应有强抑制作用。阳性对照组中加入酮康唑溶液，使其终浓度为：0025、01、05、1、10、50μmol/l，根据“22孵育体系与样品处理”项下进行反应并处理，根据1-羟基咪达唑仑的生成率来确定 CYP3A4 酶的相对活性（即实验组占阴性对照组生成率的百分比），计算半数抑制率IC50。 

　　27对rCYP3A4活性影响的初步筛选 

　　271样品配制[7]根据说明书，分别取治疗量的黄连上清丸、护肝片、牛黄解毒丸，经处理后，分别置于100ml容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，超声30min，滤过，滤液作为储备液。将中成药分为低、中、高剂量组，低、高剂量组则分别为中剂量组的1/2 和2 倍。并同时设置空白组。每个样品平行做3份。 

　　272酶孵化的条件反应体系中先分别加入PBS（pH74）、咪达唑仑、氯化镁、rCYP3A4和待测药物的储备液，置于37℃水浴中预孵化振荡5 min后，加入NADPH生成系统启动孵化反应。37℃水浴振荡反应5min后，加入冰乙腈（含内标物质-卡马西平2μg/ml）终止反应。涡旋混合1 min，-20℃下放置10min ，10000rpm离心5 min，取上清液过滤，吸取滤液20μl注入HPLC仪中，按“23色谱条件”项下色谱条件进样测定，测定咪达唑仑代谢产物1-羟基咪达唑仑的浓度。 

　　273代谢产物的测定使用HPLC仪按“23色谱条件”项下色谱条件进样分析，测定1-羟基咪达唑仑与卡马西平的含量，考察对CYP3A4活性影响较大的中成药。代谢产物1-羟基咪达唑仑的生成率越低，表示抑制作用越强。 

　　28对rCYP3A4活性抑制作用的强弱（IC50值）的计算 

　　281酶孵化的条件参见“27对rCYP3A4活性影响的初步筛选”项下“272酶孵化的条件”项操作。 

　　282代谢产物的测定参见“27对rCYP3A4活性影响的初步筛选”项下“273酶孵化的条件”项操作。 

　　283IC50的测定 通过体外初步筛选后，在固定CYP3A4浓度、探针底物咪达唑仑浓度和NADPH浓度的同时，改变待测中成药的浓度，测定不同浓度下中成药对1-羟基咪达唑仑生成率的影响，判断对CYP3A4的抑制程度，估计中成药对rCYP3A4活性的影响强弱。以中成药浓度对数值为横坐标（X），CYP3A4酶的相对活性（%）表示为纵坐标（Y），计算IC50值和95%的可信范围[8]，计算公式为：Y=min×（max-min）/ [1+10^（X-LogIC50）]。 

　　3结果 

　　31专属性考察按“23色谱条件”项下色谱条件进样测定，1-羟基咪达唑仑，卡马西平的分离度好（>15），1-羟基咪达唑仑与卡马西平出峰时间分别在154min，86min。见图1-3。 

　　32标准曲线以1-羟基咪达唑仑和卡马西平的峰面积比（Y）和含量（X）进行加权回归，得到Y=00013X+00024 （R2=09937，n=6），表明1-羟基咪达唑仑在10-1000ng范围内与峰面积线性关系良好，结果见图4。 

　　33阳性对照组酮康唑对rCYP3A4酶相对活性计算 IC50为006538μmol/l，95%区间为004542～00941，符合文献[8]范围（006～016μmol/l），表明所用的孵育体系可以满足CYP3A4酶抑制活性的评价及测定其他抑制剂IC50的要求。 

　　34对rCYP3A4活性影响的初步筛选由表3可看出：黄连上清丸、牛黄解毒丸对CYP3A4 酶表现出诱导作用，护肝片对CYP3A4 酶表现出抑制作用。 

　　4讨论 

　　CYP3A4肝脏和肠道重要代谢酶，含量可达到肝脏CYP450总量的60%，肠道CYP450总量的70%[9]，是药物代谢的主角。中成药说明书中【药物相互作用】栏均未见报道，只是简单书写“如与其他药物同时使用可能会发生药物相互作用，详情请咨询医师或药师”。基于此，本研究对完善中成药的说明书有一定帮助作用，对临床合理用药提供参考性依据。实验结果显示，黄连上清丸、牛黄上清丸对CYP3A4有诱导作用，护肝片对CYP3A4有抑制作用，护肝片的IC50为4055g，因此在使用时，要考虑其潜在的药物相互作用。 

　　参考文献 

　　[1] 刘艳，王海霞，黄丽军，等.大鼠肝微粒体法测定3种中药对CYP3A4亚型的作用[J].医药导报，2011，30（3）：285-289. 

　　[2] Bill J Gurley， Stephanie F Gardner， Martha A Hubbard， et al. Clinical assessment of effects of botanical supplementation on cytochrome P450 phenotypes in the elderly： St johns' wort， garlic oil Panaxginseng and Ginkgo biloba[J]. DrugsAging， 2005，22（6）：525-539. 

　　[3] 郑晓燕.26种中药提取物对CYP3A4和CYP2D6代谢的抑制作用[J].国外医学：中医中药分册，2004，27（4）：232. 

　　[4] 任秀华，曹磊，斯陆勤，等.rCYP3A4孵育条件的优化及其中1-羟基咪达唑仑含量测定[J].医药导报，2010，29（4）：418-421. 

　　[5] 沈玉捷.高效液相色谱法测定大鼠肝微粒体CYP3A4和CYP2E 1的活性及其应用[D].大连医科大学，2013. 

　　[6] Valquiria A.P.Jabor， Eduardo B. Coelho，Neife A.G. dos Santos，et al.A highly sensitive LC–MS–MS assay for analysis of midazolam and its major metabolite in human plasma：Applications to drug metabolism[J].Journal of Chromatography B，2005，822：27-32 

　　[7] 杨旭平，赖丹，黄毅岚，等.5 种抗肿瘤中药注射液对 CYP3A4 酶代谢的影响[J].华西药学杂志， 2014，29（5）：550-552. 

　　[8] Yao M，Zhu M，Sinz MW，et al.Development and full validation ofsix inhibition assays for five major cytochrome P450 enzymes inhuman liver microsomes using an automated 96-well microplateincubation for matand LC /MS /MS analysis[J].J Pharm BinmedAna1，2007，44（1）：211-223. 

　　[9] 刘建平，李高.生物药剂学与药物动力学[M].4版.北京：人民卫生出版社，2008：130-156.