穿心莲甲羟戊酸5—焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达
2022-06-09
【论文摘要】穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分，广泛用于抗炎。为了对它的生物合成进行遗传调控，提高内酯类成分的合成量，作者在转录组数据分析的基础 上，获得了穿心莲内酯生物合成途径中甲羟戊酸 5-焦磷酸脱羧酶基因的3个克隆，包含的ORF均长1 260 bp，分别在4个位点具有单碱基的差异。它们编码由419个残基组成的氨基酸序列；保守结构域中均具有11个高度保守的氨基酸，分别决定催化反应的特异性 和活性；N端不含有质体定位的信号肽；与丹参的MVD蛋白（GenBank 号AEZ55675.1）一致性较高。在穿心莲茎和叶片中，MVD基因的表达量分别在花蕾期和初花期最高，但各时期表达量的倍数差异不大。该研究获得的 MVD基因，为后续进行详细的功能解析，并进一步应用于穿心莲内酯的遗传调控，奠定了基础。
【论文关键词】穿心莲；穿心莲内酯；生物合成途径；MVD基因；克隆；表达
[Abstract]Andrographolide is a main bioactive substance in Andrographis paniculata， and extensively used in anti-inflammatory drugs. In order to increase andrographolide production in plant， three 1260 bp ORFs encoding mevalonate disphosphate decarboxylases with 419 amino acids were cloned from A. paniculata by RACE method and analyzed by bioinformatic software. Their tissue expression patterns were predicted by real time PCR. Eleven conserved amino acid residues determining specificity and activity of these MVDs were predicted in these amino acid sequences， but no plastid targeted signal peptides were detected. These MVDs have high similarities with the MVD protein （GenBank number： AEZ55675.1） from Salvia miltiorrhiza. In stems and leaves， expression levels of these MVD genes were constant， and reached the highest level at bud stage and the beginning of flowering. The MVD genes we have cloned from A. paniculata could be used in genetic engineering of andrographolide biosynthsis pathway in future.
[Key words]Andrographis paniculata； andrographolide； biosynthsis pathway； MVD gene； cloning； expression
穿心莲内酯系爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees的次生代谢产物，被誉为天然、安全的中药抗生素。临床上已经开发出多种药品，广泛应用于治疗上呼吸道感染，急、慢性支气管炎，病毒性肺炎，扁桃体 炎，咽喉炎，急性胃炎，肠炎，细菌性痢疾，感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，咳嗽头痛，痢疾腹泻等，疗效明显，其注射剂被卫生部及国家中医药管理局列为急诊 科必备药品之一。穿心莲内酯在避免抗生素滥用方面发挥了重要的作用。
穿心莲种质资源的起源中心在印度和斯里兰卡，为了保护有限的遗传资源，在当地被禁止出口。我国引种穿心莲至少已有80年历史，广东、广西、福 建、安徽、四川、陕西和云南等各地多引种栽培生产，药材用于临床配方和提取穿心莲内酯的原料。笔者等的研究表明，全国各地产穿心莲中穿心莲内酯含量差异较 大（0.63%～3.69%）[1-2]，而各地引种穿心莲的种源单一，种质遗传背景相似，具有较高的遗传脆弱性。为了促进相关医药产业的可持续发展，利用基因工程手段改造穿心莲内酯合成途径，提高活性成分含量，是一条切实可行的途径。
作为二萜类内酯化合物，穿心莲内酯经由2种生物合成途径产生，一个是细胞质中的甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径，另一个是质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4- phosphate，MEP）途径。在MVA途径中，异戊烯基焦磷酸（isoprenyl diphosphate，IPP）是各步反应的重要原料。IPP是在ATP的作用下，由甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶（mevalonate disphosphate decarboxylase，MVD）催化（3R）-甲羟戊酸5-焦磷酸底物，发生3-羟基磷酸化和脱羧反应后生成的，MVD蛋白对穿心莲内酯的合成量起 决定作用。MVD蛋白进行催化反应时，需要Mg2+和ATP的参与[3]；催化时磷酸化反应和脱羧反应是分步进行的[4]。
目前，印度研究人员正在进行穿心莲转录组测序；广州中医药大学已经完成了穿心莲叶绿体基因组测序工作。前期作者已经从穿心莲中克隆了穿心莲内 酯生物合成途径中的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因。迄今未有穿心莲中MVD基因的研究报道，本研究在综合分析转录组和基因组测序结果的基础上，从穿心莲中 获得了MVD基因的3个克隆。以上工作，为后续进行穿心莲内酯生物合成途径的遗传调控奠定了坚实的基础。
【论文关键词】穿心莲；穿心莲内酯；生物合成途径；MVD基因；克隆；表达
[Abstract]Andrographolide is a main bioactive substance in Andrographis paniculata， and extensively used in anti-inflammatory drugs. In order to increase andrographolide production in plant， three 1260 bp ORFs encoding mevalonate disphosphate decarboxylases with 419 amino acids were cloned from A. paniculata by RACE method and analyzed by bioinformatic software. Their tissue expression patterns were predicted by real time PCR. Eleven conserved amino acid residues determining specificity and activity of these MVDs were predicted in these amino acid sequences， but no plastid targeted signal peptides were detected. These MVDs have high similarities with the MVD protein （GenBank number： AEZ55675.1） from Salvia miltiorrhiza. In stems and leaves， expression levels of these MVD genes were constant， and reached the highest level at bud stage and the beginning of flowering. The MVD genes we have cloned from A. paniculata could be used in genetic engineering of andrographolide biosynthsis pathway in future.
[Key words]Andrographis paniculata； andrographolide； biosynthsis pathway； MVD gene； cloning； expression
穿心莲内酯系爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees的次生代谢产物，被誉为天然、安全的中药抗生素。临床上已经开发出多种药品，广泛应用于治疗上呼吸道感染，急、慢性支气管炎，病毒性肺炎，扁桃体 炎，咽喉炎，急性胃炎，肠炎，细菌性痢疾，感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，咳嗽头痛，痢疾腹泻等，疗效明显，其注射剂被卫生部及国家中医药管理局列为急诊 科必备药品之一。穿心莲内酯在避免抗生素滥用方面发挥了重要的作用。
穿心莲种质资源的起源中心在印度和斯里兰卡，为了保护有限的遗传资源，在当地被禁止出口。我国引种穿心莲至少已有80年历史，广东、广西、福 建、安徽、四川、陕西和云南等各地多引种栽培生产，药材用于临床配方和提取穿心莲内酯的原料。笔者等的研究表明，全国各地产穿心莲中穿心莲内酯含量差异较 大（0.63%～3.69%）[1-2]，而各地引种穿心莲的种源单一，种质遗传背景相似，具有较高的遗传脆弱性。为了促进相关医药产业的可持续发展，利用基因工程手段改造穿心莲内酯合成途径，提高活性成分含量，是一条切实可行的途径。
作为二萜类内酯化合物，穿心莲内酯经由2种生物合成途径产生，一个是细胞质中的甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径，另一个是质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4- phosphate，MEP）途径。在MVA途径中，异戊烯基焦磷酸（isoprenyl diphosphate，IPP）是各步反应的重要原料。IPP是在ATP的作用下，由甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶（mevalonate disphosphate decarboxylase，MVD）催化（3R）-甲羟戊酸5-焦磷酸底物，发生3-羟基磷酸化和脱羧反应后生成的，MVD蛋白对穿心莲内酯的合成量起 决定作用。MVD蛋白进行催化反应时，需要Mg2+和ATP的参与[3]；催化时磷酸化反应和脱羧反应是分步进行的[4]。
目前，印度研究人员正在进行穿心莲转录组测序；广州中医药大学已经完成了穿心莲叶绿体基因组测序工作。前期作者已经从穿心莲中克隆了穿心莲内 酯生物合成途径中的香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因。迄今未有穿心莲中MVD基因的研究报道，本研究在综合分析转录组和基因组测序结果的基础上，从穿心莲中 获得了MVD基因的3个克隆。以上工作，为后续进行穿心莲内酯生物合成途径的遗传调控奠定了坚实的基础。