动物皮张基因组DNA三种提取方法比较
2022-06-09
【论文摘要】以干燥的驴皮张样品为试验材料，将SDS-蛋白酶K法与Chelex-100法相结合，创新性地引入玻璃奶DNA纯化技术，提取全基因组DNA，并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取方法和试剂盒提取方法进行比较分析。结果表明，本研究发明方法提取的基因组DNA纯度较高，杂质较少，且操作简单，所用试剂、仪器费用较低，能更好地应用于分子生物学实验。
【论文关键词】动物皮张；DNA提取；玻璃奶
DNA为分子生物学研究的基础，随着生物领域尤其是遗传学方面研究的日渐深入，从分子水平上对动物进行物种鉴定、物种起源和多样性评估及其亲缘关系研究已获得广泛应用。20世纪80年代就已开始动物皮张标本DNA提取的研究，尽管提取成功的报道很多，但提取的基因组DNA含量较低，片段较短，且难以进行PCR扩增；提取方法虽然不断改善，但得到的DNA质量仍旧不是很高。
当前皮张源性鉴定方法滞后，国内外仍然没有统一的技术标准和较成熟的鉴别方法，传统的宏观观察法、显微镜观察法具有一定的主观性，无法准确和快速地区分皮张源性。随着分子生物学技术的发展，基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来。DNA分子鉴定法主要是利用显示生物特征的各生物物种所具有的不同DNA序列信息进行源性鉴别，它可以突破依据动物纤维结构形态进行鉴定的局限性，与传统分析方法相比，更加客观和准确。因此，获得高质量的动物皮张基因组DNA已成为进行皮张源性鉴定研究的迫切要求。
本试验以SDS法为基础，将蛋白酶K、Chelex-100与GlassMilkDNA提取技术相结合，并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取新方法和DNA提取试剂盒法进行比较分析，旨在研建一种操作简便、DNA提取效率高、花费较为低廉的优化方法，为后续分子生物学实验提供必要条件。
1材料与方法
1.1试验材料
9份干燥的驴皮样品，分别编号为1～9。每份样品平均分为三份，分别用于A、B、C三种方法。材料由山东省农业科学院生物技术研究中心测序中心提供。
1.2试验试剂
（1）消化缓冲液A（10mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，0.5%SDS，pH8.0）、Chelex-100、20mg/mL蛋白酶K、氯仿、GlassMilk、DNABindingBuffer、70%酒精、无水乙醇、TE缓冲液、超纯水。
（2）消化缓冲液B（10mmol/LTris-HCl，0.5%SDS，1mmol/LCaCl2，0.2mg/mL蛋白酶K，pH8.0）、1μmol/LEDTA、10%Chelex溶液、酚、氯仿、异戊醇、3mol/LNaAc、无水乙醇、75%酒精、TE缓冲液、超纯水。
（3）DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TissueDNAKit）。
（4）HiFiBuffer：TransTaqDNAPolymoraseHighFidelity购自北京全式金生物技术有限公司。
1.3试验方法
1.3.1基因组DNA提取方法A：取约30mg驴皮样品研磨至微粒，分别装到编号为A1～A9的2mLEP管中，加1mL去离子水洗涤2次；加入400μL消化缓冲液A以及380μL5%的Chel-ex-100和20μL20mg/mL的蛋白酶K，50～600C水浴保温，期间搅拌混匀，至全部溶解；取出冷却至室温，振荡5～10s，100℃沸水浴8min；结束后取出样品，10000r/min离心1min，取上清转至新的EP管（记录上清体积），加等体积氯仿，充分混匀，12000r/min离心5min，重复此步骤两次；向收集液中加入5μLGlassMilk，并加600μLDNABindingBuffer.充分混匀，65℃水浴15min；后室温放置5min，8000r/min离心1min，弃上清；加入70%酒精500μL进行洗涤，8000r/min离心1min，重复此步骤两次；加入500μL无水乙醇，吹打悬浮，8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心30s，用10μL枪头吸走残余液体，室温干燥10min；加入50μLTE缓冲液（pH7.0），70℃水浴5min，快速离心，移至新离心管，-200C保存。
方法B参考陈旧皮张DNA提取新方法[12]。
方法C参考DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TissueDNAKit）。
1.3.2基因组DNA检测（1）紫外分光光度计检测：每份DNA样品分别取2μL测定其浓度及A260和A280。每个样品做三个生物学重复，取均值。
（2）琼脂糖凝胶电泳检测：配置2.0%的琼脂糖凝胶，取1×LoadingBuffer10μL，加入2μL基因组DNA样品，混合均匀后加入点样孔中，同时加入DNAMarker，180V电泳10min。电泳结束后，利用凝胶成像仪进行拍摄，保存图像，根据样品的条带亮度、整齐度及位置，粗略估计其纯度及片段大小。
（3）PCR扩增检测：根据驴线粒体基因组（16SrRNA）细胞色素b特异序列，利用PrimerPremier5.0设计PCR引物，上游引物MtUF：5'-ATAAGACGAGAAGACCCTATCCAGC-3'，下游引物MtUR：5-ACCAITITCTGITCTCCGAGGTCAC-3'，扩增目的片段250bp。在扩增之前分别将三种方法提取的共27份基因组DNA稀释到100ng/yL待用。PCR反应总体积为25μL，其中ExTaq聚合酶0.2μL，HiFiBuffer2.5μL，dNTP2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，模板2.0μL，ddH2016.3μL。
2结果与分析
【论文关键词】动物皮张；DNA提取；玻璃奶
DNA为分子生物学研究的基础，随着生物领域尤其是遗传学方面研究的日渐深入，从分子水平上对动物进行物种鉴定、物种起源和多样性评估及其亲缘关系研究已获得广泛应用。20世纪80年代就已开始动物皮张标本DNA提取的研究，尽管提取成功的报道很多，但提取的基因组DNA含量较低，片段较短，且难以进行PCR扩增；提取方法虽然不断改善，但得到的DNA质量仍旧不是很高。
当前皮张源性鉴定方法滞后，国内外仍然没有统一的技术标准和较成熟的鉴别方法，传统的宏观观察法、显微镜观察法具有一定的主观性，无法准确和快速地区分皮张源性。随着分子生物学技术的发展，基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来。DNA分子鉴定法主要是利用显示生物特征的各生物物种所具有的不同DNA序列信息进行源性鉴别，它可以突破依据动物纤维结构形态进行鉴定的局限性，与传统分析方法相比，更加客观和准确。因此，获得高质量的动物皮张基因组DNA已成为进行皮张源性鉴定研究的迫切要求。
本试验以SDS法为基础，将蛋白酶K、Chelex-100与GlassMilkDNA提取技术相结合，并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取新方法和DNA提取试剂盒法进行比较分析，旨在研建一种操作简便、DNA提取效率高、花费较为低廉的优化方法，为后续分子生物学实验提供必要条件。
1材料与方法
1.1试验材料
9份干燥的驴皮样品，分别编号为1～9。每份样品平均分为三份，分别用于A、B、C三种方法。材料由山东省农业科学院生物技术研究中心测序中心提供。
1.2试验试剂
（1）消化缓冲液A（10mmol/LTris-HCl，25mmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，0.5%SDS，pH8.0）、Chelex-100、20mg/mL蛋白酶K、氯仿、GlassMilk、DNABindingBuffer、70%酒精、无水乙醇、TE缓冲液、超纯水。
（2）消化缓冲液B（10mmol/LTris-HCl，0.5%SDS，1mmol/LCaCl2，0.2mg/mL蛋白酶K，pH8.0）、1μmol/LEDTA、10%Chelex溶液、酚、氯仿、异戊醇、3mol/LNaAc、无水乙醇、75%酒精、TE缓冲液、超纯水。
（3）DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TissueDNAKit）。
（4）HiFiBuffer：TransTaqDNAPolymoraseHighFidelity购自北京全式金生物技术有限公司。
1.3试验方法
1.3.1基因组DNA提取方法A：取约30mg驴皮样品研磨至微粒，分别装到编号为A1～A9的2mLEP管中，加1mL去离子水洗涤2次；加入400μL消化缓冲液A以及380μL5%的Chel-ex-100和20μL20mg/mL的蛋白酶K，50～600C水浴保温，期间搅拌混匀，至全部溶解；取出冷却至室温，振荡5～10s，100℃沸水浴8min；结束后取出样品，10000r/min离心1min，取上清转至新的EP管（记录上清体积），加等体积氯仿，充分混匀，12000r/min离心5min，重复此步骤两次；向收集液中加入5μLGlassMilk，并加600μLDNABindingBuffer.充分混匀，65℃水浴15min；后室温放置5min，8000r/min离心1min，弃上清；加入70%酒精500μL进行洗涤，8000r/min离心1min，重复此步骤两次；加入500μL无水乙醇，吹打悬浮，8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心30s，用10μL枪头吸走残余液体，室温干燥10min；加入50μLTE缓冲液（pH7.0），70℃水浴5min，快速离心，移至新离心管，-200C保存。
方法B参考陈旧皮张DNA提取新方法[12]。
方法C参考DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.TissueDNAKit）。
1.3.2基因组DNA检测（1）紫外分光光度计检测：每份DNA样品分别取2μL测定其浓度及A260和A280。每个样品做三个生物学重复，取均值。
（2）琼脂糖凝胶电泳检测：配置2.0%的琼脂糖凝胶，取1×LoadingBuffer10μL，加入2μL基因组DNA样品，混合均匀后加入点样孔中，同时加入DNAMarker，180V电泳10min。电泳结束后，利用凝胶成像仪进行拍摄，保存图像，根据样品的条带亮度、整齐度及位置，粗略估计其纯度及片段大小。
（3）PCR扩增检测：根据驴线粒体基因组（16SrRNA）细胞色素b特异序列，利用PrimerPremier5.0设计PCR引物，上游引物MtUF：5'-ATAAGACGAGAAGACCCTATCCAGC-3'，下游引物MtUR：5-ACCAITITCTGITCTCCGAGGTCAC-3'，扩增目的片段250bp。在扩增之前分别将三种方法提取的共27份基因组DNA稀释到100ng/yL待用。PCR反应总体积为25μL，其中ExTaq聚合酶0.2μL，HiFiBuffer2.5μL，dNTP2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，模板2.0μL，ddH2016.3μL。
2结果与分析