高糖对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响
2022-06-09
【论文摘要】采用不同浓度葡萄糖对间充质干细胞（MSCs）增殖的影响来研究运动员补糖的MSCs效应，分别用5.0和22.5mmol/L葡萄糖预处理小鼠MSCs细胞株C3H10T1/248h后，换不同浓度葡萄糖（5.0～500.0mmol/L）持续培养或50.0～150.0mmol/L和22.5mmol/L进行12h交替培养，甲基噻唑基四唑（MTT）法检测24～192h的细胞增殖活性。结果发现：1）22.5和50.0mmol/L葡萄糖组细胞的增殖活性最佳，并称为正糖。浓度低于或高于正糖的葡萄糖称为低糖或高糖。2）22.5mmol/L正糖预处理后换不同糖浓度持续培养时，和正糖相比，高糖100.0～300.0mmol/L具有短暂促增殖作用。3）高糖长期培养抑制细胞增殖。结果说明：高糖对正糖预处理的MSCs具有短暂促增殖效应。
【论文关键词】运动生物化学；间充质干细胞；正糖；高糖；小鼠
Abstract： In order to study the mesenchymal stem cells （MSCs） effect of carbohydrate supplementation for athletes by studying the effect of glucose in different concentrations on the proliferation of MSCs， the authors pretreated cell lines C3H10T1/2 of MSCs of mice with 5.0 and 22.5 mmol/L glucose respectively for 48 h， then continuously cultured them with glucose in different concentrations （5.0～500.0 mmol/L） or alternatively cultured them with 50.0～150.0 mmol/L and 22.5 mmol/L glucose for 12 h， measured the proliferation activity of 24～192 h cells by means of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide/thiazolyl blue tetrazolium bromide （MTT） assay， and revealed the following findings： 1）the proliferation activity of the cells cultured with 22.5 and 50.0 mmol/L glucose was the best， and the glucose was called as normal glucose， while the glucose whose concentration was lower or higher than normal glucose was called as low glucose or high glucose； 2）when MSCs were pretreated with 22.5 mmol/L normal glucose and then continuously cultured with glucose in different concentrations， as compared with normal glucose， 100.0～300.0 mmol/L high glucose had a short-term proliferation promoting function； 3）longer-term high glucose culturing restrained cell proliferation. The said findings indicate that high glucose has a short-term proliferation promoting effect on MSCs pretreated with normal glucose.
Key words： sports biochemistry；mesenchymal stem cell；normal glucose；high glucose；mouse
间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。骨髓MSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、成骨细胞、软骨细胞等多种细胞的能力。研究表明，体育运动能提高MSCs增殖活性和迁移能力[1]。同时，MSCs参与了运动性骨骼肌损伤的修复过程[2]。研究发现，运动性损伤后通过提高MSCs活性可抑制炎症反应[3]、加速血管内皮细胞生长[4-5]、促进骨骼肌卫星细胞增殖和分化[6]，进而有利于运动损伤的康复[7-9]。然而，MSCs增殖活性降低将导致肌肉损伤修复过程受到抑制[6]。因此，研究MSCs增殖对于促进运动员骨骼肌损伤修复、提高运动员训练效果具有重要的现实意义。
既往研究发现，无论对于短时间大强度、间歇性运动还是对于耐力性运动而言，在运动前、中、后进行适度科学的补充葡萄糖，既能维持血糖的平衡、提高肌糖原的合成速率、降低运动后迅速上升的肌酸激酶（creatinekinase，CK）水平，同时也能抑制运动导致活动肌损伤后的炎症反应、促进损伤部位的骨骼肌再生，从而减轻运动性肌肉损伤，促进运动能力恢复[10]。普遍认为，补糖量一般不超过60g/h或1g/min[11-12]。Depner等[13]研究了补充不同浓度葡萄糖对延迟性肌肉酸痛（delayedonsetmusclesoreness，DOMS）炎症过程的影响。他们发现，与补充低浓度葡萄糖相比，受试者运动过程中的补高浓度的葡萄糖组加重了运动24h后肌肉的酸痛感，同时也增加炎症因子白介素（interleukin，IL）-1β和IL-6的蛋白表达。Zehnder等[14]对运动后补糖对DOMS骨骼肌糖原重新合成和肌肉损伤恢复的影响的研究也发现，运动后补糖（>10g/kg）导致DOMS骨骼肌的糖原在运动后24h肌糖原合成进一步减少，运动后DOMS的骨骼肌损伤指标无机磷酸盐和无机磷酸盐/磷酸肌酸显著性增加，进而间接抑制肌肉再生。这些研究提示，运动补糖呈现出浓度依赖性特点。然而，这一特点是否与MSCs增殖活性有关尚不清楚。
本实验研究不同葡萄糖浓度对MSCs增殖的影响，从MSCs角度揭示运动员补糖的浓度依赖特点，为科学补糖提供理论依据。
1材料和方法
1.1主要材料和仪器
C3H10T1/2细胞株是小鼠骨髓来源的MSCs，购自中国科学院上海细胞库；特殊定制的无糖Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco'smodifiedEaglemedium，DMEM）购自Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；甲基噻唑基四唑（the3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）细胞计数试剂盒购自碧云天生物技术研究所；其它相关试剂都购自美国Sigma公司。
1.2细胞培养及处理
1）常规培养。
将C3H10T1/2细胞接种于22.5mmol/L的D-葡萄糖、10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素的增殖DMEM培养基中，置于体积分数为5%二氧化碳、饱和湿度、37℃的细胞培养箱中培养。常规胰酶消化，细胞传代，隔天换液。
2）检测细胞增殖活性。
（1）不同糖浓度预处理后更换多个糖浓度培养细胞。
【论文关键词】运动生物化学；间充质干细胞；正糖；高糖；小鼠
Abstract： In order to study the mesenchymal stem cells （MSCs） effect of carbohydrate supplementation for athletes by studying the effect of glucose in different concentrations on the proliferation of MSCs， the authors pretreated cell lines C3H10T1/2 of MSCs of mice with 5.0 and 22.5 mmol/L glucose respectively for 48 h， then continuously cultured them with glucose in different concentrations （5.0～500.0 mmol/L） or alternatively cultured them with 50.0～150.0 mmol/L and 22.5 mmol/L glucose for 12 h， measured the proliferation activity of 24～192 h cells by means of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide/thiazolyl blue tetrazolium bromide （MTT） assay， and revealed the following findings： 1）the proliferation activity of the cells cultured with 22.5 and 50.0 mmol/L glucose was the best， and the glucose was called as normal glucose， while the glucose whose concentration was lower or higher than normal glucose was called as low glucose or high glucose； 2）when MSCs were pretreated with 22.5 mmol/L normal glucose and then continuously cultured with glucose in different concentrations， as compared with normal glucose， 100.0～300.0 mmol/L high glucose had a short-term proliferation promoting function； 3）longer-term high glucose culturing restrained cell proliferation. The said findings indicate that high glucose has a short-term proliferation promoting effect on MSCs pretreated with normal glucose.
Key words： sports biochemistry；mesenchymal stem cell；normal glucose；high glucose；mouse
间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。骨髓MSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、成骨细胞、软骨细胞等多种细胞的能力。研究表明，体育运动能提高MSCs增殖活性和迁移能力[1]。同时，MSCs参与了运动性骨骼肌损伤的修复过程[2]。研究发现，运动性损伤后通过提高MSCs活性可抑制炎症反应[3]、加速血管内皮细胞生长[4-5]、促进骨骼肌卫星细胞增殖和分化[6]，进而有利于运动损伤的康复[7-9]。然而，MSCs增殖活性降低将导致肌肉损伤修复过程受到抑制[6]。因此，研究MSCs增殖对于促进运动员骨骼肌损伤修复、提高运动员训练效果具有重要的现实意义。
既往研究发现，无论对于短时间大强度、间歇性运动还是对于耐力性运动而言，在运动前、中、后进行适度科学的补充葡萄糖，既能维持血糖的平衡、提高肌糖原的合成速率、降低运动后迅速上升的肌酸激酶（creatinekinase，CK）水平，同时也能抑制运动导致活动肌损伤后的炎症反应、促进损伤部位的骨骼肌再生，从而减轻运动性肌肉损伤，促进运动能力恢复[10]。普遍认为，补糖量一般不超过60g/h或1g/min[11-12]。Depner等[13]研究了补充不同浓度葡萄糖对延迟性肌肉酸痛（delayedonsetmusclesoreness，DOMS）炎症过程的影响。他们发现，与补充低浓度葡萄糖相比，受试者运动过程中的补高浓度的葡萄糖组加重了运动24h后肌肉的酸痛感，同时也增加炎症因子白介素（interleukin，IL）-1β和IL-6的蛋白表达。Zehnder等[14]对运动后补糖对DOMS骨骼肌糖原重新合成和肌肉损伤恢复的影响的研究也发现，运动后补糖（>10g/kg）导致DOMS骨骼肌的糖原在运动后24h肌糖原合成进一步减少，运动后DOMS的骨骼肌损伤指标无机磷酸盐和无机磷酸盐/磷酸肌酸显著性增加，进而间接抑制肌肉再生。这些研究提示，运动补糖呈现出浓度依赖性特点。然而，这一特点是否与MSCs增殖活性有关尚不清楚。
本实验研究不同葡萄糖浓度对MSCs增殖的影响，从MSCs角度揭示运动员补糖的浓度依赖特点，为科学补糖提供理论依据。
1材料和方法
1.1主要材料和仪器
C3H10T1/2细胞株是小鼠骨髓来源的MSCs，购自中国科学院上海细胞库；特殊定制的无糖Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco'smodifiedEaglemedium，DMEM）购自Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；甲基噻唑基四唑（the3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT）细胞计数试剂盒购自碧云天生物技术研究所；其它相关试剂都购自美国Sigma公司。
1.2细胞培养及处理
1）常规培养。
将C3H10T1/2细胞接种于22.5mmol/L的D-葡萄糖、10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素的增殖DMEM培养基中，置于体积分数为5%二氧化碳、饱和湿度、37℃的细胞培养箱中培养。常规胰酶消化，细胞传代，隔天换液。
2）检测细胞增殖活性。
（1）不同糖浓度预处理后更换多个糖浓度培养细胞。