崇阳县猪伪狂犬病毒感染调查
2022-06-09
摘要：为了解湖北省崇阳县猪伪狂犬病毒的感染状况，应用PCR技术对来自崇阳县不同规模7个种猪场的126份公猪精液进行了猪伪狂犬病毒（PRV）的检测，阳性率为0；同时采取了这7个已使用猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗免疫血清420份，采用了猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行了血清学抗体监测，结果检出猪伪狂犬gE抗体阳性10份，阳性率为2.37%。结果表明，崇阳县猪群中存在猪伪狂犬病野毒感染，但感染率较低，不同猪场感染差异大。
关键词：猪伪狂犬病毒（PRV）；PCR；基因缺失鉴别ELISA；gE抗体
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）11-009-02
伪狂犬病（Pseudorables，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病，是危害全球养猪业最严重的猪传染病之一。该病可引起种猪的不育、妊娠母猪的流产、产死胎和木乃伊胎、仔猪大量死亡等，从而造成较大的经济损失[1]。我国自1947年首次报道以来[2]，已有20多个省（市、自治区）有猪伪狂犬病的发生，2012年以来，猪伪狂犬病席卷了我国大江南北，目前，各个省市都有猪伪狂犬病的相关报道。PRV主要通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播，同时也可水平传播[3]。伪狂犬病病毒常呈隐性潜伏感染或长期带毒的状态存在，当环境激变或者被其它应激因素激发，往往可与其他病原体协同作用引起多种疾病的发生，从而引起疫病的暴发[4]。目前规模猪场普遍采取人工授精技术，如果公猪健康带毒或者精液中存在带毒情况，则很容易通过精液传播造成疫病的扩散与流行。因此，做好种猪场猪伪狂犬病的病原检测和血清学检测，及时清除隐性带毒猪，净化猪群至关重要。
1 材料与方法
1.1 材料
公猪精液采自崇阳7个种猪场，共126份。
猪血清采自7个已使用gE基因缺失苗至少半年以上的母猪场，随机抽样采血共420份。
SDS、蛋白酶K、苯酚、氯仿、无水乙醇、dNTPs、TaqDNA聚合酶（购自TaKaRa公司）、猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒（由IDEXX提供）。
主要仪器PCR仪、凝胶成像分析仪、电泳仪、酶标仪等。
1.2 方法
1.2.1 PRV引物设计 上游引物：5′-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′；下游引物：5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′。
1.2.2 病毒总DNA 的抽提 取公猪精液500μL，加入50μL的SDS（10%），20μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，50 ℃水浴2 h，每20 min 摇匀一次。加入500 μL苯酚混匀，静置10 min，12 000 r/min 离心10 min；取上清，加入等体积苯酚、氯仿（1：1），冰浴5 min，4℃ 1 2000r/min 离心5 min；取等体积氯仿冰浴5 min，4℃，1 2000 r/min离心5 min；取上清加入2～2.5倍的无水乙醇及1/10体积的3μL/L的NaAc混匀，-20 ℃放置30 min或过夜，同上离心15 min；弃上清，加1 000μL 75%乙醇，洗涤1 次。晾干EP管中的DNA，加入30 μL的双蒸水溶解，-20 ℃保存备用。
1.2.3 PCR 反应体系与条件 PCR 反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2.0μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0μL，上、下游引物（25 pmol/L）各0.5μL，DNA模板5.0μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2μL，加H2O至25μL。PCR 反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后取7 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统上观察。
1.2.4 ELISA 检测按照猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的操作说明进行。
1.2.5 结果判定
PCR病原检测结果判定PRV阳性对照出现217 bp扩增带，阴性对照无带出现时，试验结果成立。被检样品出现217 bp扩增带为阳性，否则为阴性。
ELISA检测结果判定阴性对照A650nm的平均值减去阳性对照A650nm的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果S/N值（样品/阴性对照比率）低于或等于0.60，样品应判定为PRV gE抗体阳性。如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间隔一定时间后重新采样、检测。如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRV gE抗体阴性。
2 结果与分析
PCR扩增结果电泳检测在阳性对照有217 bp条带出现，而阴性对照无任何条带，表明实验检测结果126份公猪精液PRV的PCR扩增结果均未出现相应片段，表明无PRV感染或带毒现象存在。
PRV野毒感染的ELISA检测结果对7个母猪场的420份送检血清进行检测，结果检出血清阳性10份，阳性率为2.37%（表1）。
3 小结与讨论
（1）在本次部分种猪场伪狂犬病带毒感染情况调查中，PCR检测公猪精液的阳性率为0，说明母猪场对于公猪的伪狂犬病净化相当重视，取得了一定的成效；猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒检测母猪猪伪狂犬病野毒感染阳性率为2.37%，对于基础母猪群的伪狂犬净化还需加强。
（2）通过猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒检测，7个母猪场猪伪狂犬病野毒感染情况，各猪场之间的阳性感染率存在一定差别，有3个猪场存在猪伪狂犬病的感染；由于取样数量有限，不能完全代表我县猪伪狂犬病野毒感染水平，但说明了我县猪场存在不同程度的猪伪狂犬病毒感染，对于感染率高的猪场要及时进行全面的定期监测普查，及时清除野毒感染猪，使猪场猪群逐步得到净化。
（3）猪伪狂犬病的检测方法较多，病原学检测包括病毒的分离鉴定、PCR技术、核酸探针技术等；血清学检测主要包括ELISA、乳胶凝集试验等。传统的血清学方法常不能区分免疫抗体与感染抗体，有很大的局限性；而PCR诊断技术与猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法都具有敏感性高，能够特异性地检测出野毒感染并且快速简便，在病原检测和感染抗体监测工作中具有广泛的应用前景[5]。为猪场清除健康带毒猪，控制与净化伪狂犬病有着重要作用。
（4）猪场伪狂犬病的控制与净化工作是一项长期的系统工作，涉及到疫苗免疫、卫生消毒和饲养管理等各个方面。对于种猪场来说，应免疫和监测并重。因为带毒种猪就如散毒机器，危害性极大，不但会造成本场伪狂犬病的流行，还会造成一系列连锁反应，是导致猪场伪狂犬病暴发的直接原因。因此，做好种猪场伪狂犬病的病原检测和血清学检测，及时清除带毒种猪，净化猪群至关重要。同时，还应加强生物安全管理措施，推行封闭式管理、仔猪早期隔离断奶、小单元全进全出、二期保育等饲养模式，确保控制与净化效果。
参考文献：
[1] 殷 震，刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京：科技出版社，1997.
[2] 袁庆志，李卓然，南 锡，等.猪伪狂犬病病毒的分离与鉴定[J].中国畜禽传染病，1987（3）：10-11.
[3] 邓仕伟，薛春芳，汪 勇.我国规模化猪场对猪伪狂犬病的控制[J].中国畜牧兽医，2007，34（2）：112-114.
[4] 和花益，和喜花.福贡县猪伪狂犬病流行情况监测与分析[J].中国动物检疫，2006，23（9）：34.
[5] 付 薇，胡晓静，朱 伟，等.广西猪伪狂犬病毒感染状况调查报告[J].广东畜牧兽医科技，2008，33（6）：12-13.
关键词：猪伪狂犬病毒（PRV）；PCR；基因缺失鉴别ELISA；gE抗体
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）11-009-02
伪狂犬病（Pseudorables，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病，是危害全球养猪业最严重的猪传染病之一。该病可引起种猪的不育、妊娠母猪的流产、产死胎和木乃伊胎、仔猪大量死亡等，从而造成较大的经济损失[1]。我国自1947年首次报道以来[2]，已有20多个省（市、自治区）有猪伪狂犬病的发生，2012年以来，猪伪狂犬病席卷了我国大江南北，目前，各个省市都有猪伪狂犬病的相关报道。PRV主要通过母猪胎盘和公猪精液垂直传播，同时也可水平传播[3]。伪狂犬病病毒常呈隐性潜伏感染或长期带毒的状态存在，当环境激变或者被其它应激因素激发，往往可与其他病原体协同作用引起多种疾病的发生，从而引起疫病的暴发[4]。目前规模猪场普遍采取人工授精技术，如果公猪健康带毒或者精液中存在带毒情况，则很容易通过精液传播造成疫病的扩散与流行。因此，做好种猪场猪伪狂犬病的病原检测和血清学检测，及时清除隐性带毒猪，净化猪群至关重要。
1 材料与方法
1.1 材料
公猪精液采自崇阳7个种猪场，共126份。
猪血清采自7个已使用gE基因缺失苗至少半年以上的母猪场，随机抽样采血共420份。
SDS、蛋白酶K、苯酚、氯仿、无水乙醇、dNTPs、TaqDNA聚合酶（购自TaKaRa公司）、猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒（由IDEXX提供）。
主要仪器PCR仪、凝胶成像分析仪、电泳仪、酶标仪等。
1.2 方法
1.2.1 PRV引物设计 上游引物：5′-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3′；下游引物：5′-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3′。
1.2.2 病毒总DNA 的抽提 取公猪精液500μL，加入50μL的SDS（10%），20μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，50 ℃水浴2 h，每20 min 摇匀一次。加入500 μL苯酚混匀，静置10 min，12 000 r/min 离心10 min；取上清，加入等体积苯酚、氯仿（1：1），冰浴5 min，4℃ 1 2000r/min 离心5 min；取等体积氯仿冰浴5 min，4℃，1 2000 r/min离心5 min；取上清加入2～2.5倍的无水乙醇及1/10体积的3μL/L的NaAc混匀，-20 ℃放置30 min或过夜，同上离心15 min；弃上清，加1 000μL 75%乙醇，洗涤1 次。晾干EP管中的DNA，加入30 μL的双蒸水溶解，-20 ℃保存备用。
1.2.3 PCR 反应体系与条件 PCR 反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2.0μL，MgCl2（25 mmol/L）1.0μL，上、下游引物（25 pmol/L）各0.5μL，DNA模板5.0μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2μL，加H2O至25μL。PCR 反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后取7 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统上观察。
1.2.4 ELISA 检测按照猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的操作说明进行。
1.2.5 结果判定
PCR病原检测结果判定PRV阳性对照出现217 bp扩增带，阴性对照无带出现时，试验结果成立。被检样品出现217 bp扩增带为阳性，否则为阴性。
ELISA检测结果判定阴性对照A650nm的平均值减去阳性对照A650nm的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果S/N值（样品/阴性对照比率）低于或等于0.60，样品应判定为PRV gE抗体阳性。如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间隔一定时间后重新采样、检测。如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRV gE抗体阴性。
2 结果与分析
PCR扩增结果电泳检测在阳性对照有217 bp条带出现，而阴性对照无任何条带，表明实验检测结果126份公猪精液PRV的PCR扩增结果均未出现相应片段，表明无PRV感染或带毒现象存在。
PRV野毒感染的ELISA检测结果对7个母猪场的420份送检血清进行检测，结果检出血清阳性10份，阳性率为2.37%（表1）。
3 小结与讨论
（1）在本次部分种猪场伪狂犬病带毒感染情况调查中，PCR检测公猪精液的阳性率为0，说明母猪场对于公猪的伪狂犬病净化相当重视，取得了一定的成效；猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒检测母猪猪伪狂犬病野毒感染阳性率为2.37%，对于基础母猪群的伪狂犬净化还需加强。
（2）通过猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒检测，7个母猪场猪伪狂犬病野毒感染情况，各猪场之间的阳性感染率存在一定差别，有3个猪场存在猪伪狂犬病的感染；由于取样数量有限，不能完全代表我县猪伪狂犬病野毒感染水平，但说明了我县猪场存在不同程度的猪伪狂犬病毒感染，对于感染率高的猪场要及时进行全面的定期监测普查，及时清除野毒感染猪，使猪场猪群逐步得到净化。
（3）猪伪狂犬病的检测方法较多，病原学检测包括病毒的分离鉴定、PCR技术、核酸探针技术等；血清学检测主要包括ELISA、乳胶凝集试验等。传统的血清学方法常不能区分免疫抗体与感染抗体，有很大的局限性；而PCR诊断技术与猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法都具有敏感性高，能够特异性地检测出野毒感染并且快速简便，在病原检测和感染抗体监测工作中具有广泛的应用前景[5]。为猪场清除健康带毒猪，控制与净化伪狂犬病有着重要作用。
（4）猪场伪狂犬病的控制与净化工作是一项长期的系统工作，涉及到疫苗免疫、卫生消毒和饲养管理等各个方面。对于种猪场来说，应免疫和监测并重。因为带毒种猪就如散毒机器，危害性极大，不但会造成本场伪狂犬病的流行，还会造成一系列连锁反应，是导致猪场伪狂犬病暴发的直接原因。因此，做好种猪场伪狂犬病的病原检测和血清学检测，及时清除带毒种猪，净化猪群至关重要。同时，还应加强生物安全管理措施，推行封闭式管理、仔猪早期隔离断奶、小单元全进全出、二期保育等饲养模式，确保控制与净化效果。
参考文献：
[1] 殷 震，刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京：科技出版社，1997.
[2] 袁庆志，李卓然，南 锡，等.猪伪狂犬病病毒的分离与鉴定[J].中国畜禽传染病，1987（3）：10-11.
[3] 邓仕伟，薛春芳，汪 勇.我国规模化猪场对猪伪狂犬病的控制[J].中国畜牧兽医，2007，34（2）：112-114.
[4] 和花益，和喜花.福贡县猪伪狂犬病流行情况监测与分析[J].中国动物检疫，2006，23（9）：34.
[5] 付 薇，胡晓静，朱 伟，等.广西猪伪狂犬病毒感染状况调查报告[J].广东畜牧兽医科技，2008，33（6）：12-13.