RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR—3基因表达
2022-06-09
[摘要] 目的 应用聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）包裹淋巴管内皮祖细胞（lymphatic endothelial progenitor cells，LEPCs）血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）基因siRNA，体外沉默VEGFR-3基因表达，研究抑制LEPCs分化抗肿瘤淋巴管新生的作用。 方法 Ficoll法分离人脐血单个核细胞，流式细胞仪、免疫荧光分选并鉴定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并转染入LEPCs，流式细胞仪检测转染效率。RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白质水平VEGFR-3基因沉默效果。 结果 VEGFR-3siRNA成功转入LEPCs，转染效率30%。VEGFR-3siRNA转染组LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表达均降低（P<0.05）。 结论 体外经由PEI介导的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表达，为以LEPCs为靶点抑制肿瘤淋巴管新生提供了实验依据。
[关键词] 淋巴管内皮祖细胞；VEGFR-3；聚乙烯亚胺；siRNA；淋巴管新生
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）18-11-04
肿瘤淋巴管的新生与肿瘤转移有密切的联系，能否有效抑制肿瘤淋巴管新生成为肿瘤治疗的研究热点。2005年，Wang等[1]继Salven[2]之后提出了CD34+/CD133+/VEGFR-3+细胞为LEPCs。在趋化因子的作用下，LEPCs动员、迁移至病变组织，血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor，VEGF-C）通过VEGF-C/VEGFR-3信号途径诱导其向淋巴管内皮细胞分化，进而促使新的淋
巴管生成[3-4]。Religa等[5]对淋巴管炎症角膜小鼠进行辐射处理后输入骨髓源性的细胞，发现VEGFR-3+细胞出现在新生淋巴管中；Bogos等[6]检测到小细胞肺癌患者血中CD34与VEGFR-3双阳性细胞明显增多，且与癌细胞淋巴结转移呈正相关。上述结果提示，VEGFR-3在LEPCs参与的肿瘤淋巴管的新生中起重要作用[7]，如果我们靶向阻断VEGFR-3来抑制VEGF-C/VEGFR-3信号途径参与的肿瘤淋巴管新生，可达到抗肿瘤淋巴转移的目的。
RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞，特异性地降解靶基因的mRNA，毕业论文格式从而产生相应的功能表型缺失的技术。本实验应用RNAi技术，拟将与VEGFR-3同源的siRNA转染入LEPCs，抑制其分化为淋巴管内皮细胞，从而达到抗淋巴管新生的目的，为抗肿瘤淋巴管新生提供实验依据和方法。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
DMEM（Gibco），兔抗人VEGFR-3（Santa cruz），小鼠抗人CD133、CD34（Diagnostica），胎牛血清（四季青，杭州天杭生物科技有限公司），羊抗兔IgG FITC（Chemicon），羊抗小鼠IgG PE（Chemicon），羊抗兔IgG TRITC（Jackson），Trizol（Invitrogen），cDNA反转录试剂盒（Fermentas），Ladder DNA、蛋白质marker（Bio-rad），蛋白提取试剂盒（pierce），PEI（25kDa，Sigma Aldrich）。
流式细胞仪（FACS Calibur，FACSAria，BD）；PCR仪（9600型，PE）；转膜仪和蛋白电泳仪（Bio-rad）；恒温培养箱（Heraeu）；Olympus荧光显微镜、相差倒置显微镜（Nikon）。
1.2 单个核细胞的分离
取50～60mL足月正常分娩胎儿脐血，加入103 IU肝素。按Ficoll液密度梯度离心法[8]分离单个核细胞。将静置后的上部血液等量稀释后加于Ficoll液面上，Ficoll液与稀释血液的比例约为1∶2，离心（360g，25min）。将含有单个核细胞的液段移至另一离心管，PBS混悬后离心（250g，12min），收集细胞。
1.3 LEPCs的分选
用PBS（含1%BSA）清洗细胞，PBS混悬细胞，调整细胞密度1×107个/mL，加兔抗人VEGFR-3（1∶100），4℃孵育55min。用PBS洗3次，加1∶100 TRITC标记的羊抗兔IgG，4℃孵育30min。PBS清洗后，用DMEM（含2.5%FBS）重悬细胞[9]，FACS Aria流式细胞仪分选VEGFR-3阳性细胞。将分选出的细胞培养后进行免疫荧光鉴定CD34和CD133的表达[4]。
1.4 VEGFR-3 siRNA抑制率的检测
1.4.1 VEGFR-3 siRNA的设计（表1）与合成（上海生工）
1.4.2 体外转染 （1）siRNA/PEI溶液的制备：将制得的PEI载体溶液（1mg/mL）滴加入siRNA溶液（1μg）中（N/P=8），振荡，室温孵育30min。（2）每
孔4×104个细胞接种于24孔板至细胞汇合度40%～60%，PBS清洗，加入无血清的DMEM。（3）将siRNA/PEI溶液分别加入细胞中轻轻混匀，转染6h后，更换完全培养基。荧光显微镜观察后消化细胞，流式细胞仪分析转染效率。
1.4.3 半定量RT-PCR 实验分五组：空白转染组、对照转染组、siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组。体外转染同上，各组细胞数1×107，更换完全培养液培养至48h[10]。将Trizol 1mL加入培养皿中，吹打数次，将细胞裂解液转至1.5mL EP管中，室温静置5min；加入氯仿0.2mL，振荡15s，室温放置10min，12 000rpm，4℃离心10min；将上层液体移至另一个1.5mL EP管中，加异丙醇0.5mL，冰上放置10min，12 000rpm，4℃离心10min；弃上清加75%乙醇1mL涡旋振荡，8000rpm，4℃离心5min。弃去上清，干燥沉淀，加入40μL DEPC水溶解RNA。RT的反应条件：30℃10min，45℃ 30min，99℃ 5min，4℃ 5min；PCR反应条件：94℃ 2min，然后94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min，30个循环。VEGFR-3引物序列（f）5'TTTGTGGAGGGAAAGAATAAGA3'（r）5'GGACAGGTTGAGGGGCTA3'由上海生工合成，扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。每组分别取3个样本，实验重复3次。
1.4.4 Western blot 转染步骤同上，转染后培养72h，弃培养基，用0.01M PBS浸洗2次。加入RIPA蛋白提取试剂，冰上裂解25min；用刮勺将细胞刮取至1.5mL EP管中（冰上操作），12 000rpm，4℃离心12min，上清液转移至EP管中，BCA法测蛋白含量。各组上样量相同，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将凝胶上的蛋白用湿式电转移到PVDF膜上，用含3%BSA封闭液封闭，然后1mL兔抗人VEGFR-3抗体稀释液（1∶200）处理，以同样的方式加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育2h。用ECL法显影。
1.5 统计学分析
数据均经SPSS13.0软件进行处理，用（）表示；多组间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体外转染结果
N/P=8时，流式细胞仪检测siRNA/PEI转染组转染效率为30%。
2.2 各组VEGFR-3 siRNA抑制VEGFR-3表达的分析
2.2.1 半定量RT-PCR结果分析 各组VEGFR-3mRNA表达结果显示，空白与阴性转染组之间无差异，siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较均有显著差异，其中siRNA a组抑制效率最高（图1）。
Marker 空白 阴性 a b c
GAPDH（590bp）
[关键词] 淋巴管内皮祖细胞；VEGFR-3；聚乙烯亚胺；siRNA；淋巴管新生
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）18-11-04
肿瘤淋巴管的新生与肿瘤转移有密切的联系，能否有效抑制肿瘤淋巴管新生成为肿瘤治疗的研究热点。2005年，Wang等[1]继Salven[2]之后提出了CD34+/CD133+/VEGFR-3+细胞为LEPCs。在趋化因子的作用下，LEPCs动员、迁移至病变组织，血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor，VEGF-C）通过VEGF-C/VEGFR-3信号途径诱导其向淋巴管内皮细胞分化，进而促使新的淋
巴管生成[3-4]。Religa等[5]对淋巴管炎症角膜小鼠进行辐射处理后输入骨髓源性的细胞，发现VEGFR-3+细胞出现在新生淋巴管中；Bogos等[6]检测到小细胞肺癌患者血中CD34与VEGFR-3双阳性细胞明显增多，且与癌细胞淋巴结转移呈正相关。上述结果提示，VEGFR-3在LEPCs参与的肿瘤淋巴管的新生中起重要作用[7]，如果我们靶向阻断VEGFR-3来抑制VEGF-C/VEGFR-3信号途径参与的肿瘤淋巴管新生，可达到抗肿瘤淋巴转移的目的。
RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的dsRNA导入细胞，特异性地降解靶基因的mRNA，毕业论文格式从而产生相应的功能表型缺失的技术。本实验应用RNAi技术，拟将与VEGFR-3同源的siRNA转染入LEPCs，抑制其分化为淋巴管内皮细胞，从而达到抗淋巴管新生的目的，为抗肿瘤淋巴管新生提供实验依据和方法。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
DMEM（Gibco），兔抗人VEGFR-3（Santa cruz），小鼠抗人CD133、CD34（Diagnostica），胎牛血清（四季青，杭州天杭生物科技有限公司），羊抗兔IgG FITC（Chemicon），羊抗小鼠IgG PE（Chemicon），羊抗兔IgG TRITC（Jackson），Trizol（Invitrogen），cDNA反转录试剂盒（Fermentas），Ladder DNA、蛋白质marker（Bio-rad），蛋白提取试剂盒（pierce），PEI（25kDa，Sigma Aldrich）。
流式细胞仪（FACS Calibur，FACSAria，BD）；PCR仪（9600型，PE）；转膜仪和蛋白电泳仪（Bio-rad）；恒温培养箱（Heraeu）；Olympus荧光显微镜、相差倒置显微镜（Nikon）。
1.2 单个核细胞的分离
取50～60mL足月正常分娩胎儿脐血，加入103 IU肝素。按Ficoll液密度梯度离心法[8]分离单个核细胞。将静置后的上部血液等量稀释后加于Ficoll液面上，Ficoll液与稀释血液的比例约为1∶2，离心（360g，25min）。将含有单个核细胞的液段移至另一离心管，PBS混悬后离心（250g，12min），收集细胞。
1.3 LEPCs的分选
用PBS（含1%BSA）清洗细胞，PBS混悬细胞，调整细胞密度1×107个/mL，加兔抗人VEGFR-3（1∶100），4℃孵育55min。用PBS洗3次，加1∶100 TRITC标记的羊抗兔IgG，4℃孵育30min。PBS清洗后，用DMEM（含2.5%FBS）重悬细胞[9]，FACS Aria流式细胞仪分选VEGFR-3阳性细胞。将分选出的细胞培养后进行免疫荧光鉴定CD34和CD133的表达[4]。
1.4 VEGFR-3 siRNA抑制率的检测
1.4.1 VEGFR-3 siRNA的设计（表1）与合成（上海生工）
1.4.2 体外转染 （1）siRNA/PEI溶液的制备：将制得的PEI载体溶液（1mg/mL）滴加入siRNA溶液（1μg）中（N/P=8），振荡，室温孵育30min。（2）每
孔4×104个细胞接种于24孔板至细胞汇合度40%～60%，PBS清洗，加入无血清的DMEM。（3）将siRNA/PEI溶液分别加入细胞中轻轻混匀，转染6h后，更换完全培养基。荧光显微镜观察后消化细胞，流式细胞仪分析转染效率。
1.4.3 半定量RT-PCR 实验分五组：空白转染组、对照转染组、siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组。体外转染同上，各组细胞数1×107，更换完全培养液培养至48h[10]。将Trizol 1mL加入培养皿中，吹打数次，将细胞裂解液转至1.5mL EP管中，室温静置5min；加入氯仿0.2mL，振荡15s，室温放置10min，12 000rpm，4℃离心10min；将上层液体移至另一个1.5mL EP管中，加异丙醇0.5mL，冰上放置10min，12 000rpm，4℃离心10min；弃上清加75%乙醇1mL涡旋振荡，8000rpm，4℃离心5min。弃去上清，干燥沉淀，加入40μL DEPC水溶解RNA。RT的反应条件：30℃10min，45℃ 30min，99℃ 5min，4℃ 5min；PCR反应条件：94℃ 2min，然后94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 1min，30个循环。VEGFR-3引物序列（f）5'TTTGTGGAGGGAAAGAATAAGA3'（r）5'GGACAGGTTGAGGGGCTA3'由上海生工合成，扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。每组分别取3个样本，实验重复3次。
1.4.4 Western blot 转染步骤同上，转染后培养72h，弃培养基，用0.01M PBS浸洗2次。加入RIPA蛋白提取试剂，冰上裂解25min；用刮勺将细胞刮取至1.5mL EP管中（冰上操作），12 000rpm，4℃离心12min，上清液转移至EP管中，BCA法测蛋白含量。各组上样量相同，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将凝胶上的蛋白用湿式电转移到PVDF膜上，用含3%BSA封闭液封闭，然后1mL兔抗人VEGFR-3抗体稀释液（1∶200）处理，以同样的方式加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育2h。用ECL法显影。
1.5 统计学分析
数据均经SPSS13.0软件进行处理，用（）表示；多组间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体外转染结果
N/P=8时，流式细胞仪检测siRNA/PEI转染组转染效率为30%。
2.2 各组VEGFR-3 siRNA抑制VEGFR-3表达的分析
2.2.1 半定量RT-PCR结果分析 各组VEGFR-3mRNA表达结果显示，空白与阴性转染组之间无差异，siRNA a组、siRNA b组、siRNA c组与空白转染组和阴性转染组比较均有显著差异，其中siRNA a组抑制效率最高（图1）。
Marker 空白 阴性 a b c
GAPDH（590bp）